Wnt/β－catenin信号调控EMT水平对小鼠胚胎干细胞向肝脏组织结构分化的影响

摘要

目的在前期体外诱导小鼠胚胎干细胞（ESC）向肝系细胞分化基础上, 从细胞上皮间质转化（EMT）角度研究ESC分化为肝脏组织结构的可行性。方法选用Balb/c小鼠ESC, 首先利用肝细胞生长因子（HGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）等体外诱导ESC向肝系细胞方向分化, 然后在分化中期（13 d）、成熟期（17 d）两个时间点动态抑制细胞Wnt/β-catenin信号以降低其EMT水平。最后在分化系统中观察分化细胞保持三维组织结构生长情况, 检测其中肝系细胞和血管标志物白蛋白（ALB）、血管内皮生长因子（VEGFR）等表达情况, 综合判断有无肝脏组织形成, 并研究该过程中EMT水平变化的规律和机制。结果 ESC分化过程中, 分化前期实验组EMT水平与对照组差别不明显, 分化中、后期实验组EMT水平较对照组明显降低, 分化第18天和20天, 实验组上皮钙黏蛋白（E-cad）基因mRNA相对表达水平分别为0.61±0.15和0.47±0.05, 对照组分别为0.07±0.05和0;实验组的ALB/AFP/CK8/CK19表达水平在同期内较对照组普遍偏高, 标志物CD31/VEGFR1在分化中后期较对照组下降缓慢。在ESC培养上清液中, 实验组ALB于第11天可检测到, 浓度为（0.32±0.02）mg/L, 而对照组ALB为（0.19±0.05）mg/L;实验组尿素于第13天开始检测到, 浓度为（8.7±1.0）μmol/L, 对照组尿素浓度为（3.1±1.2）μmol/L。ALB和尿素合成在ESC分化系统培养上清中浓度随分化时间延长而明显升高, 并且实验组的ALB、尿素浓度值在相同的时间段内明显多于对照组。另外, 实验组分化细胞可保持三维组织状态生长, 对照组分化细胞最终呈单细胞状态。实验组可检测到肝系细胞标志物以及血管细胞标志物的表达, 免疫荧光结果显示类肝细胞和血管结构紧密层状排列, HE染色提示有类肝小叶结构形成, 而对照组无血管成分标志物表达。结论 ESC向肝系细胞分化中, 在分化中、后期降低EMT水平, 可有效促进ESC向肝脏组织结构分化。