限制酶介导的插入突变及其在丝状真菌中的应用

摘要

@@ 克隆基因的方法很多，通过突变是克隆基因的常用方法, 如转座子标签法常用于克隆植物病原细菌致病相关基因及植物的抗病基因。尽管转座因子在丝状真菌中也普遍存在，但对它们的转座作用和功能了解不多，迄今转座子标签法还没有发展成为标记真菌突变体和基因克隆的常规技术。而一般的UV或化学突变方法又将使突变基因的鉴定和克隆遇到许多问题。用质粒DNA转化真菌时，也会发生非同源随机插入真菌基因组而形成标记的突变体，但往往由于转化频率较低等因素而难以广泛应用。新近的研究发现，在限制酶介导下大多数真菌的质粒DNA转化频率明显提高，并且主要是单拷贝质粒的非同源整合，这种转化方法称之为限制酶介导整合（restriction enzyme-mediated integration ，REMI），其作用与原核生物的转座子技术相当（Lu et al. 1994; Shuster & Bindel-Connelley, 1999）。通过REMI插入突变获得的突变体有利于基因克隆和功能分析，因此，它有可能成为丝状真菌基因突变和标记的常规技术。rn1 丝状真菌的DNA转化与REMI转化rn1.1 丝状真菌的DNA转化rn 近年来，丝状真菌的遗传转化取得了较大进展，利用各种选择标记（如营养缺陷、药物抗性、抗生素抗性等）已有近100种丝状真菌实现了转化。丝状真菌的遗传转化绝大多数为整合转化，整合转化方式存在二种类型：一是转化DNA通过单交换异源整合到染色体上，这种异源重组是真菌转化的常见类型；二是转化DNA与染色体同源序列之间的重组，通过单交换整合到染色体DNA上或双交换取代染色体同源序列。利用质粒转化丝状真菌时异源插入基因组的特点，通过对转化子的筛选而获得带标记的目的突变体，似乎是基因标记和克隆的一个途径。有关丝状真菌整合转化突变已有一些成功的研究报道，如Aspergillus nidulans(Tilburn et al., 1990)、Neurospora crassa (Kang & Metzenberg, 1993)、Colletotrichum lindemuthianum(Dufresne et al., 1998)等，但往往由于转化频率较低、多位点插入、串联拷贝或插入位点的偏爱性等问题而不适合许多丝状真菌基因突变和标记。