幽门螺杆菌粘附素保守区蛋白的制备及其免疫原性、安全性和粘附作用的体外评价

摘要

目的通过基因工程技术制备幽门螺杆菌(Hp)保守区(AB)蛋白,并在体外探讨其安全性、免疫原性和黏附作用,以确定AB在卸疫苗研制中的应用价值.方法运用PCR技术从Hp总DNA中扩增出AB结构基因,装入pET-22b(+)载体进行序列及生物信息学分析,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,采用金属螯合亲和层析(MCAC)的方法纯化AB,免疫印迹法检测其抗原性;流式细胞术检测AB致T细胞表达FasL的作用,ELISA法测定Hp感染者血清中抗AB抗体,MTT法测定T细胞对AB的增殖反应,光镜计数法研究AB抗体对Hp与胃癌细胞粘附的影响.结果成功构建了AB的重组质粒pET-22b(+)/AB,序列分析显示获得了段588 bp的基因,完整的包含了粘附素C-端的7个保守区.Parker法和Welling法分析显示AB具有良好的抗原性.进一步应用INTERNETExPASY、NNPREDICT、ISREC等生物信息软件分析,发现其为膜孔素样结构,是跨膜区膜外区域的重要表位组成部分.在Genebank中BLAST分析了836767个蛋白序列,与其具有同源性者均为厅声外膜蛋白序列.蛋白电泳分析和凝胶扫描表明获得了高效表达AB的克隆株,其分子量为22.5kD,占菌体总蛋白的29.6%,其中可溶性表达占上清的21.9%,纯化后获得纯度达90%的重组蛋白AB,免疫印迹显示该蛋白可被AlpA兔抗血清抗体识别;体外安全性实验表明AB无明显调节T细胞表达FasL的作用;ELISA法共检测了55份血清,同时以RUT作为平行对照,两法的评价判断一致性程度的指标卡帕系数为0.76.同时,低剂量AB即可刺激Hp+PBL的增殖;AB抗血清能部分阻断Hp与胃癌细胞系的粘附,在光镜卜表现为经抗AB兔血清预处理后,每细胞周围粘附的细菌数较免疫前兔血清预处理组显著减少(p＜0.05).结论获得HeAB的基因工程蛋白产物,为Hp疫苗研制提供了一种新抗原,生物信息学分析显示其为良好的抗原成分;体外实验证实AB是安全的、具有免疫原性的Hp菌体成分,既可以刺激体液免疫,又能够提高细胞免疫,并巳其抗体还可防止Hp与胃上皮细胞的粘附.