RUNX1c及GATA2表达质粒构建及其在肝细胞中表达的鉴定

摘要

目的 构建含RUNX1c及GATA2基因的表达质粒,探讨水动力转染法能否实现其在小鼠肝中的表达.方法 采用PCR方法 分别扩增RUNX1c及GATA2基因序列,并分别连入T载体中,通过双酶切、连接反应将2个基因序列分别连入慢病毒载体pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV中.将含RUNX1c及GATA2基因的慢病毒毒液转染至L-02细胞,通过qPCR方法 检测目的 基因表达.通过水动力高压转染方法 将此两种质粒通过尾静脉注入小鼠体内,于转染24 h,取小鼠肝组织,对组织切片进行抗RUNX1及GATA2抗体的免疫荧光染色;于转染72 h,通过流式细胞术分选肝组织中GFP+细胞,实时定量PCR(qPCR)检测RUNX1c、GATA2及造血相关基因的表达.结果 经双酶切及测序鉴定证明,pCDH-MCS-T2A-RUNX1c-copGFP-MSCV、pCDH-MCS-T2A-GATA2-copGFP-MSCV质粒构建成功.通过体外实验证实这两个载体携带的RUNX1c及GATA2基因能在人肝细胞系L-02中表达.水动力高压转染法可使含RUNX1c及GATA2的质粒进入肝组织,并在肝细胞中表达RUNX1及GATA2蛋白.通过分选肝组织中GFP+细胞,可发现这些细胞内过表达RUNX1及GATA2基因,Fli-1、Erg基因的表达也明显提高.结论 成功构建了含有造血转录因子RUNX1c、GATA2基因的表达载体,并通过水动力转染法实现RUNX1c、GATA2的表达载体在小鼠肝中的表达,为进一步研究肝中过表达造血转录因子能否实现肝细胞转分化为造血细胞及观察其对造血系统修复的作用奠定基础.