肝细胞生长因子真核表达质粒的构建、鉴定及表达

摘要

目的: 本实验通过设计特定引物，从含人肝细胞生长因子(human hepatocyte growth factor hHGF)的人肝脏组织总RNA中，利用聚合酶链反应扩增出hHGF cDNA，构建重组pcDNA3.1+-hHGF真核表达质粒，继而转染人胚肾293T细胞，应用ELISA方法检测细胞培养液上清中肝细胞生长因子表达，并为下一步研究肝细胞生长因子奠定基础。 方法: 1.设计两端合适酶切位点的引物，利用高保真、长片段PCR技术扩增制备HGF cDNA，利用琼脂糖胶回收试剂盒回收纯化目的片段。 2.利用TA克隆技术，将hHGF cDNA与T载体pGEM-T进行连接，转化入DH5 α感受态细胞，构建pGEM-T-hHGF。经蓝白斑筛选后，抽提质粒进行酶切鉴定和DNA测序。 3.将测序正确的pGEM-T-hHGF用NheI和BamH I依次酶切，将所得hHGF cDNA片段与同样酶切亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1+质粒载体，转化E.coli DH5α，构建pcDNA3.1+-hHGF重组质粒。随机挑选白色菌落，抽提质粒进行酶切鉴定和DNA测序。并中量制备质粒。 4.将重组质粒pcDNA3.1+-hHGF转染293T细胞，应用ELISA方法检测肝细胞生长因子在293T细胞中的表达。 结果: 1.将以人肝组织总RNA为模板扩增的PCR扩增产物进行0.6％琼脂糖凝胶电泳，产物主要为单一、清晰条带，大小约为2.2kb。 2.对pGEM-T-hHGF和pcDNA3.1+-hHGF分别进行酶切鉴定及DNA序列分析。酶切鉴定表明HGF cDNA为2211bp的DNA片段。两个重组质粒测序结果相同，且与Genbank中人类(Homo Sapiens)HGF基因序列一致，证实pGEM-T-hHGF和pcDNA3.1+-hHGF重组质粒构建成功。 3.将重组质粒pcDNA3.1+-hHGF转染293T细胞，应用ELISA方法于转染后12、24、48、72小时检测到肝细胞生长因子表达。 结论: 1.本实验克隆的基因为序列正确的人HGF基因cDNA序列。 2.重组质粒pcDNA3.1+-hHGF是具有表达功能的真核表达质粒。 3.pcDNA3.1+-hHGF转染293T细胞后，其表达产物是分泌性hHGF蛋白。

目录

论文说明：缩略词表

声明

前言

第一部分肝细胞生长因子真核表达质粒的构建及鉴定

材料和方法

1材料：

2方法

结果

第二部分293T细胞的培养、转染及hHGF表达的鉴定

材料和方法

1材料

2方法

结果

讨论

结论

论文图片

参考文献

综述 肝细胞生长因子概述

攻读硕士学位期间发表学术论文题目

致谢