利用单线虫两重PCR技术对秀丽隐杆线虫线粒体DNA拷贝数进行相对定量的方法

摘要

目的 基于单线虫两重PCR技术,利用细胞核DNA(nDNA)作为内参研究秀丽隐杆线虫线粒体相对数量的实验条件,进而建立一种相对定量秀丽隐杆线虫线粒体DNA(mtDNA)拷贝数的方法.方法 首先以秀丽隐杆线虫nDNA和mtDNA序列为模板,利用多重PCR引物设计软件MPprimer和引物特异性评估软件MFEprimer V2.0设计两重PCR引物;然后针对以单线虫为PCR扩增模板的处理条件进行摸索,包括蛋白酶K的消化浓度及反应时间;最后研究秀丽隐杆线虫nDNA片段和mtDNA片段扩增后到达平台期的时间,进而比较不同循环数扩增下秀丽隐杆线虫线粒体拷贝数相对定量的可行性.结果 单线虫经蛋白酶K 60℃消化及95℃灭活处理后,能较特异地扩增出nDNA和mtDNA;单线虫PCR模板的处理条件为50 μg/ml蛋白酶K 60℃处理2 min并于95℃灭活10 min;线粒体拷贝数相对nDNA而言,趋于稳定的PCR循环数为26.结论 建立了一种以为nDNA内参快速相对定量线粒体拷贝数的方法,为线粒体DNA拷贝数相关的实验研究提供了技术支撑.