发色底物法在酶促反应初速度内测定α1抗胰蛋白酶的活性

摘要

目的 优化发色底物法,使其在酶促反应初速度内测定α1抗胰蛋白酶（AAT）的活性并用于血浆蛋白纯化过程中各样品活性的检测。方法 采用酶标仪动态监测模式观察酶浓度和反应时间对酶促反应的影响;计算初速度并确定被底物饱和的最大酶浓度。将AAT与胰蛋白酶孵育,剩余靶酶和底物作用产生的光密度可反映AAT的活性。通过△D与AAT标准品活性进行拟合建立标准曲线,测定相关样品的活性,进行精密度和准确度验证。结果 胰蛋白酶浓度为0.0625 mg/ml,20 min内酶促反应处于初速度内。AAT标准曲线范围为200~1200 IU/ml,r〉0.99。该法测定CohnⅣ、前处理液、洗脱峰样品中AAT的活性分别为（720.59±18.63）、（601.84±19.18）、（568.09±24.83）IU/ml。每个样品之间的RSD〈10%,加样回收率均在90%~110%。结论 发色底物法经优化后,准确度和精密度大幅度提高,更适于实验室制备AAT或不同生产阶段样品的活性检测。