重叠PCR合成蓖麻毒素B链基因及其在大肠杆菌中表达和抗原性分析

摘要

目的:表达蓖麻毒素B（RTB）链蛋白,为制备RTB特异性抗体奠定基础。方法:采用密码子优化软件对RTB编码基因序列重新优化设计,以18条长片段寡核苷酸引物经两步重叠PCR合成RTB基因片段,并在RTB的C端引入6×H is标签序列,插入表达载体pBV220,转化E.coliDH5α获得表达工程菌株,并对诱导表达条件和纯化条件进行优化。利用W estern印迹和间接ELISA方法鉴定重组RTB蛋白的抗原性。结果:表达工程菌株E.coliDH5α在42℃经诱导3 h后获得包涵体形式表达的目的蛋白,约占菌体总蛋白的65.48%,SDS-PAGE分析显示表达的蛋白区带与RTB相对分子质量相符,为29×103左右。表达产物经N i-NTA亲和层析法一步纯化,蛋白纯度达96.21%,并可得到约25 mg/L重组RTB蛋白。结论:在国内首次应用重叠PCR合成RTB基因并实现高表达,纯化重组RTB蛋白可被抗天然蓖麻毒素多抗所识别,为制备特异性抗体及建立快速检测方法打下了基础。