重组酶聚合酶扩增结合CRISPR-Cas12a快速检测十足目虹彩病毒1方法的建立

摘要

[背景]十足目虹彩病毒1 (Decapod Iridescent Virus 1,DIV1)可感染南美白对虾、中国对虾和日本对虾等,是危害对虾养殖业的主要病毒之一.当前高效、快速、简便地检测对虾是否感染DIV1是减少其发生和危害的重要途径.[目的]将成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)及其相关蛋白12a (CRISPR Associated Protein 12a,Cas12a),即CRISPR-Cas12a系统,与重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)技术相结合,建立快速检测DIV1的方法(RPA-Cas 12a),并探讨该方法在实际样本检验中的应用价值.[方法]通过提取DIV1 DNA,设计其RPA引物、crRNA及报告探针,优化并建立RPA结合CRISPR-Cas12a的快速检测方法,进一步分析该方法检测DIV1的灵敏度与特异性,并比较建立的方法与qPCR法的一致性.[结果]建立的RPA-Cas12a快速检测方法可在40 min内实现对虾样本DNA中DIV1的检测,检测限为10 copies/reaction.用该方法分别对对虾白斑综合征病毒(White Spot SyndromeⅥrus,WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus,IHHNV)、虾肝肠胞虫(Enterocytozoon Hepatopenaei EHP)及DIV1进行检测,结果仅DIV1发生特异性反应,而WSSV、IHHNV和EHP的检测结果均为阴性.采用RPA-Cas12a检测61份实际样本,结果均与qPCR检测法的阳性检出率一致.[结论]建立的RPA-Cas12a方法检测十足目虹彩病毒1具有快速、简便、灵敏度高且特异性强的特点,为十足目虹彩病毒1的快速检测提供了新的工具.