表达EGFP报告基因口蹄疫病毒亚基因组复制子的构建

摘要

[目的]构建含有EGFP报告基因的口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子系统.[方法]利用融合PCR方法,将EGFP报告基因替换O型FMDV全长cDNA克隆中的前导蛋白Lb和结构蛋白P1基因,构建含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子FMDV-EGFP.复制子质粒连续转化、测序检验复制子载体的稳定性.NotI线性化的复制子FMDV-EGFP用脂质体介导法转染表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞后,不同时间段观察EGFP荧光表达情况.转染的细胞用流式、间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot检测该复制子载体的自主复制能力和口蹄疫病毒蛋白的表达情况.[结果]复制子质粒的连续转化及测序表明报告基因可以稳定存在.FMDV-EGFP复制子转染BSR/T7细胞3h后在荧光显微镜下能够看到绿色荧光,EGFP荧光信号随着转染时间的延长逐渐增加,并且荧光信号可持续6d以上.转染24 h后的细胞流式分析显示转染的细胞中有6.0％发出荧光,说明构建的复制子载体能够有效表达EGFP蛋白.另外,间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot方法也检测到该复制子RNA在BSR/T7细胞中能够进行自主复制,并且能够表达病毒的非结构蛋白.[结论]含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子的成功构建为进一步研究病毒复制、翻译机制及筛选抗病毒药物等奠定了坚实的基础.