复制子

摘要： 2020年的最后一天,中国新冠疫苗上市,国人为此振奋。然而此情此景,赵振东却再也无法看到。连续200多天进行疫苗技术攻坚,期间未有一天停歇,赵振东带领7人团队在实验室内完成了疫苗研发、中和抗体筛选、抗病毒药物筛选和复制子体系的构建,这意味着以前必须在生物安全三级实验室做的实验,现在能在生物安全二级实验室开展,为我国针对新冠病毒的抗病毒药物研发提供了重要的实验体系和技术支撑。

摘要： [背景]以往双歧杆菌质粒分类学研究较少,双歧杆菌属质粒系统分类方法缺失.[目的]建立双歧杆菌属天然质粒系统分类和鉴定方法,促进质粒在双歧杆菌生物学研究中的理解和应用.[方法]利用质粒复制起始蛋白进化树和基因组共线性分析方法,对目前所有已测序的双歧杆菌属天然质粒进行系统分类研究.[结果]双歧杆菌所有已知天然质粒可以划分为6个不同类型的质粒家族和3个独特的复合质粒,家族Ⅲ和家族Ⅵ质粒可进一步划分为不同的亚型类群.家族Ⅲ质粒是双歧杆菌属天然质粒的主要类型和优势家族.家族Ⅵ质粒成员亚型分类最丰富.在质粒家族水平,2种方法的分类结果完全一致.[结论]本文揭示了所有分析质粒之间的系统分类关系,建立了双歧杆菌属天然质粒系统的分类标准、方法和体系,可为今后双歧杆菌天然质粒分类和鉴定提供重要的理论参考和分类依据.

摘要： 为构建一种重组乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制子模型,使其能够在病毒感染的细胞中表达可视化报告基因蛋白,本研究删除HBV基因组核心蛋白(HBV core,HBc)编码区部分序列,构建HBV1.1-ΔHBc113复制子载体。利用内含肽(intein)介导蛋白拼接的特性,选取加强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和超级折叠绿色荧光蛋白(super folder green fluorescent protein,sfGFP)作为外显肽,建立EGFP^(N1-8)/EGFP^(C9-11)和sfGFP^(N1-10)/sfGFP^(C11)蛋白分裂系统。基于ΔHBc113载体,分别构建EGFP^(C9-11)和sfGFP^(C11)重组HBV复制子;应用DNA印迹法(Southern blotting)验证两种rHBV载体的细胞内复制能力。结果显示,构建的HBV1.1-ΔHBc113复制子载体能够在HBc反式互补条件下在转染细胞中形成病毒复制。构建的EGFP^(C9-11)和sfGFP^(C11)重组HBV复制子能够支持HBc互补条件下的细胞内病毒复制,并产生子代病毒颗粒;HBV重组复制子表达的EGFP^(C9-11)或sfGFP^(C11)蛋白在共表达氮端蛋白EGFP^(N)/sfGFP^(N)细胞中,通过intein介导的蛋白质高效拼接,能够形成完整的、有功能的GFP。结果表明,构建的荧光蛋白重组HBV复制子系统能够为HBV高通量药物筛选和HBV易感性研究提供实验工具,具有重要的病毒学意义和应用前景。

摘要： 为建立短乳杆菌天然质粒分类方法,通过质粒复制起始蛋白(replication initiation protein,Rep)进化树和基因组共线性分析,将短乳杆菌51 个天然质粒可以准确、有效地划分为6 个家族类型和11 个亚家族类型,并在家族4质粒中发现了一种新的复制子类型.研究结果表明,质粒Rep进化树和基因组共线性分析都是短乳杆菌天然质粒有效的分类方法,分类结果为今后短乳杆菌天然质粒科学分类和理性应用提供了理论研究依据.%This study aimed to establish a method for the classification of natural plasmids from Lactobacillus brevis . A total of 51 natural plasmids of L. brevis were accurately and efficiently divided into 6 family types and 11 subfamily types through the replication initiation protein (Rep) phylogenetic tree and genome colinearity analysis. A new type of replicon was found in the plasmids of family 4. The results showed that both the Rep phylogenetic tree and genome colinearity analysis were effective methods for the classification of natural plasmids in L. brevis. The classification results will provide a theoretical foundation for the scientific classification and reasonable application of L. brevis natural plasmids in the future.

摘要： 为建立植物乳杆菌天然质粒分类方法,以质粒复制起始蛋白(replication initiation protein,Rep)作为分类标记,通过系统进化树分析方法,将植物乳杆菌53个编码Rep天然质粒划分为6个质粒类型,包括5个质粒家族和1个新的复制类型质粒,之后进一步提出了每个质粒家族特有的骨干序列,最终建立了一种简单、有效的植物乳杆菌天然质粒的分类方法和标准.与以往质粒功能和不相容性分类方法相比较,本方法具有较好的实用性和通用性.%This study aimed to establish a classification method for natural plasmids of Lactobacillus plantarum (L.plantarum) by using plasmid replication initiation protein (Rep) as a taxonomic marker.Fifty three plasmids encoding Rep in L.plantarum were divided into six plasmid types by the method of phylogenetic analysis,including five plasmid families and one novel replication type of plasmid.Then,the backbone sequence specific to each plasmid family was further proposed.Finally,a simple and effective classification method and criterion for L.plantarum natural plasmids was established.Compared with the previous classification methods based on plasmid function and incompatibility,this method displayed relatively better practicability and versatility.

摘要： 为构建表达绿色荧光蛋白(GFP)的复制缺陷型西尼罗病毒(WNV),本研究参考NY99株WNV基因组序列,分段合成除结构蛋白基因外的其它基因组序列,以及插入缺失的结构蛋白基因位置的gfp报告基因序列,并按WNV基因组顺序克隆于pCI-neo载体中,构建含有GFP基因的WNV复制子重组质粒pWNVrep-GFP;同时构建表达WNVC蛋白的重组质粒pCAG-WNV-C.将pWNVrep-GFP和pCAG-WNV-C共转染稳定表达WNVprM-E蛋白的W-92细胞系进行WNV粒子包装及病毒粒子拯救.结果显示转染细胞能够表达GFP,将转染细胞培养液接种BHK-21细胞后,能感染细胞并且表达GFP,western blot可以检测到分子质量为42 ku的NS1蛋白条带.然而,感染BHK-21细胞的培养液不能再感染BHK-21细胞,表明拯救的病毒只具有一次感染能力,为复制缺陷型病毒.WNV阳性血清能中和拯救病毒对BHK-21细胞的感染,该复制缺陷型病毒为WNV中和抗体检测和疫苗评价提供了相关的技术平台.%To generate a replication-defective West Nile virus (WNV) expressing green fluorescent protein (GFP) reporter gene,the full length cDNA of WNV was chemically synthesized with the gpfgene replaced the viral structural proteins (C/PrM/E)encoding sequence according to the sequence of NY99 strain and inserted into the eukaryotic expression plasmid pCI-neo to construct the WNV replicon plasmid of pWNVrep-GFP.Then the virus was rescued by co-transfecting the pWNVrep-GFP with arecombinant plasmid pCAG-WNV-C expressing capsid protein of WNV into envelope protein prM-E expressing W-92 cell line,which displayed GFP expression in the cytoplasm.In addition,the rescued virus in the medium collected from transfected cells was able to infect BHK-21 cells,in which the viral NS1 protein was identified by western blot.However,the rescued WNV from cell medium was able to infected and replicated only in the first passage of BHK-21 cells,but failed to continue infecting or passing in the next passage of BHK-21 cells,indicating the rescued WNV was the replication-defective virus,which only possessed single-round infection.Moreover,the neutralization assay showed that the replication-defective virus was efficiently inhibited by WNV-neutralizing antibody.In conclusion,the established a WNV replication defective virus system provided useful assay plat form to be applicate in detection of neutralizing antibody to WNV and evaluation of the vaccines.

摘要： [目的]构建含有EGFP报告基因的口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子系统.[方法]利用融合PCR方法,将EGFP报告基因替换O型FMDV全长cDNA克隆中的前导蛋白Lb和结构蛋白P1基因,构建含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子FMDV-EGFP.复制子质粒连续转化、测序检验复制子载体的稳定性.NotI线性化的复制子FMDV-EGFP用脂质体介导法转染表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞后,不同时间段观察EGFP荧光表达情况.转染的细胞用流式、间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot检测该复制子载体的自主复制能力和口蹄疫病毒蛋白的表达情况.[结果]复制子质粒的连续转化及测序表明报告基因可以稳定存在.FMDV-EGFP复制子转染BSR/T7细胞3h后在荧光显微镜下能够看到绿色荧光,EGFP荧光信号随着转染时间的延长逐渐增加,并且荧光信号可持续6d以上.转染24 h后的细胞流式分析显示转染的细胞中有6.0％发出荧光,说明构建的复制子载体能够有效表达EGFP蛋白.另外,间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot方法也检测到该复制子RNA在BSR/T7细胞中能够进行自主复制,并且能够表达病毒的非结构蛋白.[结论]含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子的成功构建为进一步研究病毒复制、翻译机制及筛选抗病毒药物等奠定了坚实的基础.

摘要： 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）疫苗的研制迄今已取得部分成功，但为机体提供的保护有限，故PRRSV疫苗的研发仍然是极具挑战的任务。目前市场上有2种类型的PRRSV疫苗：病毒结构经过修改的活病毒疫苗（更有效）和灭活疫苗。

摘要： 应用中草药治疗丙型肝炎报道较多，然而这些研究大多采用中药复方制剂进行临床治疗，疗效局限。由于一种中药含有多种活性物质，某些物质之间在体内甚至有相互拮抗的作用，因此，对于治疗结果的作用机理很难阐述清楚。简述了HCV假病毒、复制子和全长细胞培养系统的研究现状，并对应用HCV RNA细胞模型研究中药单体或有效成分进行抗HCV实验研究的相关进展进行了综述，为中药治疗丙型肝炎研究提供新思路。%Many studies have shown that Chinese herb extracts could treat patients who suffer hepatitis C.However,the clinical efficacy is limited due to the use of traditional Chinese medicine (TCM)compounds.Because each drug contains multiple active substances,some of which may even act against each other in vivo,it is hard to clarify the mechanism of treatment.The current research on pseudotyped hepatitis C virus (HCV),replicon,and cell culture system is summarized,and the advances in antiviral research on the monomers or active compo-nents of Chinese herbs in vitro based on HCV RNA models are reviewed,thus providing new ideas for TCM treatment of hepatitis C.

摘要： 分子佐剂具有增强免疫原性的功能,DNA疫苗的分子佐剂就是与DNA疫苗所编码的抗原基因共同作用于机体后,分子佐剂的基因表达产物通过一系列抗原递呈途径,调节DNA疫苗抗原基因所诱导的免疫应答的强弱和类型,提高免疫的效果的一类分子.本研究的目的是评价单个复制子DNA载体共表达IL-4和抗原增强疫苗的免疫原性，以筛选有效的疫苗载体用于DNA疫苗的研究;同时确定共表达是递送抗原和分子佐剂有效的方式，能够增强疫苗的免疫原性和有效性，可以使抗原和分子佐剂同时表达于一个环境，更好地诱导机体产生强的免疫应答。此外，共表达这种方式能够减少疫苗载体的数量，仅仅一个单一载体代替两个载体，更适合于DNA疫苗的研发与应用。

摘要： 从新的暴发性丙型肝炎病毒株来源的基因、使用该基因获得的具有高复制效率的HCV复制子RNA、以及用该复制子RNA转染的HCV复制子-复制细胞。通过使用如上所述的HCV复制子RNA和HCV复制子-复制细胞，可以连续大量产生HCV蛋白。

摘要： 本发明公开基于lacZ基因和pUC复制子的原核启动子报告系统，该报告系统包括源自pFLX107的pUC复制子，Cat基因，rrnbT1T2，lambda t0转录终止子，源自质粒pRCL且内部ClaI、SacI和NdeI位点被沉默突变的lacZ基因。本发明还公开原核启动子报告系统的构建方法及应用。本发明构建的质粒pFGH06大小为4949bp，28°C培养条件下的背景活性仅为12.2±0.6，极显著低于低拷贝参考质粒pRCL的背景活性21.3±1.7，并应用于诱导型启动子araBAD和组成型启动子rpsM的克隆及活性测定，在模拟应用于启动子筛选时，可通过蓝白斑筛选实现对目标启动子的100%识别。

摘要： 本发明在Ti质粒的左边界(left border，LB)与右边界(right border，RB)序列之间包含基于双生病毒(geminivirus)的复制子(replicon)的用于在T0代植物体的基因组内无需插入复制子即可编辑基因组的重组载体以及包括通过在上述重组载体中插入外源基因来转化植物细胞的步骤的在T0代植物体的基因组内无需插入复制子即可编辑基因组的方法。

摘要： 本发明公开了一种能在黑曲霉细胞内自主复制的复制子，所述复制子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述复制子是以19种真菌基因组为模板构建宏基因组文库，转化黑曲霉孢子筛选得到，所述复制子来自淡紫色拟青霉基因组。本发明的复制子可以在黑曲霉表达系统中发挥复制功能，并且可以提供比AMA1复制子更高的稳定性，为首次在除构巢曲霉以外的真菌中发现的复制子，丰富了复制子元件库，拓展了丝状真菌利用复制子的选择多样性。

摘要： 本发明公开了一种用于抑制HCV复制子复制的抗核酸酶的RNA适体。这种适体能特异性地结合HCV NS5B并抑制HCV复制子的增殖，其由至少一个选自包含SEQ ID NOS.3和4的组的序列组成，其中氟基团取代U(尿嘧啶)和C(胞嘧啶)碱基上的2′－羟基，并且SEQ IDNO.4以胆固醇基在5′末端和idT在3′末端标记。该RNA适体可用于HCV感染中的诊断和治疗。

摘要： 从新的暴发性丙型肝炎病毒株来源的基因、使用该基因获得的具有高复制效率的HCV复制子RNA、以及用该复制子RNA转染的HCV复制子－复制细胞。通过使用如上所述的HCV复制子RNA和HCV复制子－复制细胞，可以连续大量产生HCV蛋白。

摘要： 本发明公开基于lacZ基因和pUC复制子的原核启动子报告系统，该报告系统包括源自pFLX107的pUC复制子，Cat基因，rrnbT1T2，lambda t0转录终止子，源自质粒pRCL且内部ClaI、SacI和NdeI位点被沉默突变的lacZ基因。本发明还公开原核启动子报告系统的构建方法及应用。本发明构建的质粒pFGH06大小为4949bp，28°C培养条件下的背景活性仅为12.2±0.6，极显著低于低拷贝参考质粒pRCL的背景活性21.3±1.7，并应用于诱导型启动子araBAD和组成型启动子rpsM的克隆及活性测定，在模拟应用于启动子筛选时，可通过蓝白斑筛选实现对目标启动子的100%识别。

摘要： 本发明提供了重组复制子和所述重组复制子用于表达所分泌的所关注蛋白质以便诱导增强的免疫应答的方法。

摘要： 本发明涉及基因工程技术领域，具体公开了一种6a型丙肝病毒(HCV)亚基因组复制子及应用。所述复制子包括在NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白、NS5B蛋白上的适应性突变。本发明的6a型HCV毒株来自中国，其获得的6a型丙肝病毒亚基因组复制子模型RNA复制非常高效(RNA复制表达量达到109.8拷贝/μg RNA)，且有对应的高效全长感染性克隆。本发明还利用该复制子系统检测了对IFNα2b、Daclatasvir和Sofosbuvir药物的敏感性，证明了复制子是良好的药物筛选模型。另外，本发明还利用SGR‑CH6a系统研究了3’UTR区域的序列差异在复制环节的影响和作用。

摘要： 本发明公开了一种提高基因表达的RNA复制子及其应用，所述RNA复制子包括：5’和3’非翻译区；非结构蛋白基因编码区、亚基因组启动子、目的基因编码区。本发明通过PCR定点突变技术引入的非结构蛋白区域突变体可复制型RNA，通过Lipofectamine2000或者纳米粒转染至哺乳动物真核生物细胞，可显著增强其下游亚基因组启动子介导的包括GM‑CSF、IFN‑γ、IL‑2、IL‑12、IL‑15在内的细胞因子、趋化因子表达，可以应用于肿瘤、传染性疾病、自身免疫性疾病、遗传性疾病或心血管疾病的治疗。