蜡样芽孢杆菌聚乙烯醇脱氢酶的表达及酶学特性

摘要

【背景】聚乙烯醇脱氢酶(polyvinyl alcohol dehydrogenase,PVADH)能够使聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)氧化脱氢,在PVA的生物降解过程中起到重要作用。【目的】从PVA降解菌株蜡样芽孢杆菌DG01中获取pvadh基因,实现PVADH在毕赤酵母中的异源表达并探究其对不同型号PVA的降解特异性,为PVADH在PVA实际降解中的应用提供指导。【方法】通过反转录扩增技术获得长度为1965 bp的pvadh基因片段,构建pPIC9K-cpvadh重组表达质粒并在毕赤酵母GS115中实现异源表达,甲醇诱导表达蛋白,进行分离纯化后对其酶学性质及降解特异性进行研究。【结果】最佳发酵条件下PVADH粗酶液酶活达到54.55 U/mL。经分离纯化后表达蛋白PVADH的比酶活为173.42 U/mg,分子量为67.1 kDa,等电点为6.06,该酶最适作用温度为41℃,最适作用pH值为7.5,在27−32℃、pH 7.0−8.0条件下酶的半衰期超过4 h,1 mmol/L的Ca^(2+)对酶活力有激活作用。PVADH分别作用于PVA1788、PVA1799及PVA2488,Km值分别为1.17、1.49、1.21 mg/mL。【结论】毕赤酵母表达的PVADH产酶及纯化方便,酶学性质稳定,对醇解度小的PVA具有更好的降解能力。