森林脑炎病毒(TBEV)实时定量TaqMan PCR检测方法的建立

摘要

目的 建立快速检测TBEV的实时定量TaqMan PCR方法 .方法 根据GenBank发表的TBEV全基因组序列资料,在其C基因和NS5基因区段设计TBEV的特异探针和引物,在E基因区段设计普通PCR引物.以MDJ01株作为待检毒株,黄病毒属的另外7株病毒用来评价检测体系的特异性.测定病毒的TCID50值并制备病毒拷贝数标准品,分别用于制作病毒滴度和拷贝数标准曲线.与常规PCR方法进行了灵敏度比较,并建立了病毒感染小鼠的检测模型.结果 该检测方法的灵敏度可达到100拷贝/反应或0.1 TCID50,是常规PCR方法的十倍.作为对照的黄热病毒疫苗株17D、登革1～4型病毒、日本脑炎病毒、西尼罗病毒Chin-01株结果均为阴性,证明该体系具有良好的特异性.经过多批次、不同浓度样品的重复检测,批内和批间变异系数均小于5%,表明该体系具有较好的稳定性和重复性.结论建立了一种灵敏、特异、简便易行的TBEV的TaqMan实时定量PCR检测方法 ,为TBEV的预防控制和诊断提供了一种技术手段.