大鼠B细胞淋巴瘤-2基因的克隆及其慢病毒表达载体的构建

摘要

目的 克隆大鼠B细胞淋巴瘤-2(bcl-2)基因全长cDNA,构建及鉴定大鼠bcl-2基因慢病毒表达载体.方法 采用RT-PCR法从大鼠脾脏组织中扩增全长bcl-2 cDNA,将扩增产物克隆至pMD18-T载体中,测序正确后,将基因连接到慢病毒载体pGC-FU(含EGFP 基因)中,构建慢病毒载体表达质粒pGC-FU-bcl-2,将pGC-FU-bcl-2质粒和包装质粒(pHelper1.0、pHclp-er2.0)共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞后,细胞即可分泌携带bcl-2基凶的重组慢病毒.将重组慢病毒感染293T细胞,通过Western blot-ring鉴定目的 蛋白bcl-2的表达.结果 经DNA序列分析测定证实大鼠bcl-2基因序列与GenBank中一致;pGC-FU-bcl-2中携有正确的bcl-2基因,并能转染人胚肾上皮细胞;pGC-FU-bcl-2及包装质粒共转染包装细胞293T细胞能产生重组病毒pGC-FU-bcl-2;目的 基因bcl-2能被重组慢病毒高效地转导人人胚肾上皮细胞中,并达到稳定表达,荧光显微镜下能直接观察到荧光蛋白,Westernblotting能榆测到bcl-2蛋白在靶细胞中的表达.结论 成功克隆了大鼠bcl-2基因并构建了重组慢病毒载体,包装出高浓度慢病毒,转染人胚肾上皮细胞后能够稳定表达bcl-2基因,为进一步研究该基因的功能及细胞凋亡相关疾病的治疗奠定了基础.