RGD修饰携带tumstatin及eGFP新型腺病毒载体的构建及其表达研究

摘要

目的 构建RGD修饰表达绿色荧光蛋白(eGFP)和肿瘤抑素(tumstatin)的新型腺病毒载体.方法 PCR扩增tumstatin基因,经克隆后构建pAd5-CMV/tumstatin穿梭载体.重叠PCR方法将RGD序列插入到Ad5纤维蛋白的HI环中,获得pMfiber-RGD穿梭载体.穿梭载体与腺病毒骨架载体线性化后共转化E.coli BJ5183,构建pAd-RGD-eGFP骨架载体.最后,使用磷酸钙法将pAd5-CMV/tumstatin穿梭载体和pAd-RGD-eGFP骨架载体共转化HEK293细胞.7～10d后收集细胞裂解物得到Ad-RGD-tumstatin/eGFP病毒.将经过修饰的Ad-RGD-tumstatin/eGFP和未修饰的Ad-WT-tumstatin/eGFP病毒分别感染脑胶质瘤U87MG细胞(病毒剂量分别为1、10、100Vp/细胞),通过观察其荧光强度评估其感染效率.以上两种病毒分别感染HeLa细胞,并分别采用RTPCR及Western blotting检测tumstatin细胞mRNA及培养上清中蛋白的表达水平.结果 病毒感染48h后,可观察到修饰后的腺病毒Ad-RGD-tumstatin/eGFP对U87MG细胞的感染效率明显高于未修饰的腺病毒Ad-WT-tumstatin/eGFP.RT-PCR及Westem blotting可检测剑感染Ad-RGD-tumstatin/eGFP后的HeLa细胞中tumstatin的转录和表达.结论 成功构建经RGD修饰并表达tumstatin和eOFP基因的新型腺病毒载体,为进一步研究tumstatin在低表达柯萨奇一腺病毒受体的肿瘤中的作用奠定了良好基础.