中国家蚕抗菌肽CBM1、CBM2的克隆和表达研究

摘要

根据所测定的中国产家蚕CBM1和CBM2 cDNA序列,设计成熟肽的特异性引物,将此基因与凝血因子Xa(FXa)的切割序列以PCR方法连接起来,克隆至pGEX-KG表达质粒中.该载体为改进的GST融合表达质粒,所携带的6个Gly有助于提高FXa的切割效率.克隆得到的融合载体在大肠杆菌JM109中扩增和筛选.经DNA测序,证实为含有正确序列的乙酰化的pGEX-KG-FXa-NCBM1(pKG-FXa-NCBM1)、非乙酰化的pGEX-KG-FXa-CBM1(pKG-FXa-CBM1)和乙酰化的pGEX-KG-FXa-NCBM2(pKG-FXa-NCBM2)、非乙酰化的pGEX-KG-FXa-CBM2(pKG-FXa-CBM2).将该载体在BL21中诱导表达,得到GST-FXa切割位点NCBM1、CBM1、NCBM2、CBM2等4种融合蛋白.经SDS-PAGE,考马斯亮兰染色后,Lab-Work扫描,其表达产物达到15%～20%,每升培养液平均可得20 mg融合蛋白.菌体总蛋白经GST-亲和层析柱得到纯的GST-FXa-NCBM1、GST-FXa-CBM1、GST-FXa-NCBM2、GST-FXa-CBM2融合蛋白,再经FXa酶切后,透析过柱得到重组的NCBM1和CBM1.平板抑菌试验证明,4种融合蛋白均有明显的生物学活性,且没有显著的差异.