毛竹阿拉伯糖-5-磷酸异构酶的基因克隆、原核表达及纯化

摘要

毛竹Phyllostachys edulis阿拉伯糖-5-磷酸异构酶(Pe KdsD)是2-酮-3-脱氧辛糖酸(KDO)生物合成途径的第1个关键酶.采用逆转录实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)克隆得到毛竹KdsD基因.该基因cDNA全长1 038 bp,编码346个氨基酸;对不同物种来源的KdsD氨基酸序列进行比对和系统进化树分析.结果表明:毛竹的KdsD与玉米Zea mays等植物来源的KdsD有很高的序列一致性,而与微生物来源的KdsD序列一致性较低.毛竹不同组织实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)结果表明:PeKdsD基因在叶中表达量远远高于其他组织.在大肠埃希菌Escherichia coli原核表达系统中获得了KdsD的可溶性高表达蛋白,将大量表达的重组蛋白经过Ni-NTA亲和层析和分子筛层析(SEC)进行纯化,发现KdsD在溶液(30 mmol· L-1三羟甲基氨基甲烷pH 8.0,200 mmol· L-1氯化钠)中以多种聚体的形式存在;酶学性质测定的结果表明:毛竹KdsD酶最适pH值为pH 8.5,最适作用温度为37℃.此结果为后期研究植物KdsD蛋白的结构与功能奠定了基础.