微RNA-133a-3p靶向调控转化生长因子-β1/Smad3对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的影响

摘要

目的探讨微RNA(miR)-133a-3p靶向调控转化生长因子-β_(1)(TGF-β_(1))/Smad3对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的影响及机制。方法选择2020年2月至2021年2月焦作市人民医院皮肤科收治的瘢痕疙瘩患者29例为研究对象,手术切取瘢痕疙瘩组织及其周围正常皮肤组织,分离培养瘢痕疙瘩成纤维细胞(KF)和正常皮肤组织成纤维细胞(NF)。取对数生长期KF细胞,随机分为空白对照组、miR-阴性对照(NC)组、miR-133a-3p组、miR-133a-3p+pcDNA3.1组、miR-133a-3p+pcDNA3.1-TGF-β_(1)组;空白对照组细胞不做任何转染,miR-NC组细胞转染miR-NC,miR-133a-3p组细胞转染miR-133a-3p mimic,miR-133a-3p+pcDNA3.1组细胞共转染miR-133a-3p mimic和pcDNA3.1,miR-133a-3p+pcDNA3.1-TGF-β_(1)组细胞共转染miR-133a-3p mimic和pcDNA3.1-TGF-β_(1)。实时荧光定量聚合酶链反应法检测组织和细胞中miR-133a-3p和Ⅰ型胶原蛋白(collagen Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(collagen Ⅲ)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA的表达,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞增殖活力,流式细胞术检测细胞凋亡情况。应用TargetScan数据库通过生物信息分析预测miR-133a-3p与TGF-β_(1)的3′非翻译区(3′-UTR)存在结合位点,构建含有预测结合位点的野生型(Wt)和突变型(Mt)TGF-β_(1)3′-UTR片段的荧光素酶报告基因载体,分别将用脂质体2000包裹的Wt TGF-β_(1)或Mt TGF-β_(1)报告基因载体与miR-133a-3p mimics或miR-NC共转染入KF细胞,将转染后的细胞设为miR-NC+Wt TGF-β_(1)组、miR-133a-3p+Wt TGF-β_(1)组、miR-NC+Mt TGF-β_(1)组、miR-133a-3p+Mt TGF-β_(1)组,双荧光素酶检测试剂盒检测4组细胞双荧光素酶活性。Western blot检测空白对照组、miR-NC组、miR-133a-3p组KF细胞中TGF-β_(1)、Smad3蛋白的相对表达量。结果瘢痕疙瘩组织中miR-133a-3p相对表达量显著低于正常皮肤组织(t=18.988,P0.05)。miR-133a-3p组细胞凋亡率显著高于空白对照组和miR-NC组,细胞增殖活力显著低于空白对照组和miR-NC组(t=13.912、14.227、-8.020、-6.947,P0.05)。miR-133a-3p+Wt TGF-β_(1)组细胞相对荧光素酶活性显著低于miR-NC+Wt TGF-β_(1)组、miR-NC+Mt TGF-β_(1)组、miR-133a-3p+Mt TGF-β_(1)组(t=-15.729、-19.490、-16.186,P0.05)。KF细胞中Smad3和TGF-β_(1)蛋白相对表达量显著高于NF细胞(t=5.758、9.027,P0.05)。结论过表达miR-133a-3p可通过负调控TGF-β_(1)抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖,促进细胞凋亡,提示miR-133a-3p/TGF-β_(1)通路可能是瘢痕疙瘩治疗的一个新的靶点。