MiR-1224-5p通过TGF-β1/Smad3通路影响瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡及侵袭

摘要

瘢痕疙瘩是一种良性肿瘤，临床表现为异常的增生，超出创伤的范围，侵犯临近组织，不能自行消退。瘢痕疙瘩常发生于耳部、下颌部、前胸部、肩背部及四肢关节等部位。瘢痕疙瘩的特征是成纤维细胞过度增殖和胶原的过度生成，经常引起瘙痒、疼痛、外观不良及功能障碍。临床上虽然瘢痕疙瘩的治疗方式多样，如手术，激素局部注射和放疗等，但是瘢痕疙瘩的发病机制仍不明确，目前对瘢痕疙瘩发病机制的研究是急需解决的一大难题。 MicroRNA(miRNA)是一类单链非编码小分子RNA，影响多种细胞生物过程，如增殖、凋亡、分化及细胞外基质的产生。迄今为止，研究已经发现了miRNA参与多种疾病的发生和发展，如结直肠癌，乳腺癌，肺癌，淋巴瘤和肝脏肿瘤等。越来越多的证据表明在一些炎症及皮肤肿瘤中的miRNA表达异常，包括瘢痕疙瘩。 目前，国内外关于miRNA在瘢痕疙瘩发病机制中研究尚处于起步阶段。既往的研究发现miR-1224-5p在肿瘤发生中发挥重要作用，参与了细胞的增殖、凋亡。miRNA被发现在一些肿瘤中存在异常表达，例如直肠癌、胶质瘤、肺癌等，但其在瘢痕疙瘩发病中的具体作用尚不清楚。本研究拟通过在体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞中转染miR-1224-5p模拟物实现miR-1224-5p的过表达，研究miR-1224-5p对纤维化经典通路TGF-β1/Smad3以及对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡及侵袭的影响，探讨其在瘢痕疙瘩发病机制中可能的作用，并为瘢痕疙瘩的靶向治疗和联合治疗提供新的理论依据。 第一部分MiR-1224-5p在瘢痕疙瘩组织及成纤维细胞中的表达 目的 验证瘢痕疙瘩组织及成纤维细胞中miR-1224-5p的表达水平 方法 收集瘢痕疙瘩患者及正常皮肤组织，并分别原代培养瘢痕疙瘩及正常成纤维细胞，予免疫荧光进行细胞鉴定。采用实时荧光定量PCR检测miR-1224-5p在11组瘢痕疙瘩、正常皮肤组织及成纤维细胞中表达的差异性。 结果 （1）对原代培养的成纤维细胞进行波形蛋白免疫荧光染色，证实原代培养的细胞为较高纯度的成纤维细胞，而非类上皮细胞；（2）实时荧光定量 PCR 检测miR-1224-5p在瘢痕疙瘩组织及细胞中的表达与正常组相比表达明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 （1）miR-1224-5p在瘢痕疙瘩组织中的相对表达量低于正常皮肤组织，说明miR-1224-5p在瘢痕疙瘩及正常皮肤中表达存在明显差异。（2）与正常皮肤成纤维细胞相比，miR-1224-5p在瘢痕疙瘩成纤维细胞中显著低表达，提示miR-1224-5p可能对瘢痕疙瘩成纤维细胞起到抑制生长的作用。 第二部分MiR-1224-5p调控瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡及侵袭的机制研究 目的 探讨miR-1224-5p对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡及侵袭等生物学行为的影响及其相关分子机制 方法 将瘢痕疙瘩成纤维细胞分为五组进行转染，分别为对照组，转染模拟物无意义序列对照组，转染miR-1224-5p模拟物组，转染miR-1224-5p抑制物阴性对照组及转染miR-1224-5p抑制物组。运用实时荧光定量PCR验证转染模拟物及抑制物后各组细胞中miR-1224-5p的表达水平是否符合实验要求。通过CCK-8及EdU实验检测各组成纤维细胞增殖能力，Transwell实验检测各组成纤维细胞侵袭能力，流式细胞仪检测各组成纤维细胞凋亡情况。运用Western Blot技术检测与细胞增殖及凋亡相关分子caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白水平变化，并通过实时荧光定量PCR及Western Blot检测TGF-β1、Smad3的RNA及蛋白水平变化。 第二部分MiR-1224-5p调控瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡及侵袭的机制研究 目的 探讨miR-1224-5p对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡及侵袭等生物学行为的影响及其相关分子机制 方法 将瘢痕疙瘩成纤维细胞分为五组进行转染，分别为对照组，转染模拟物无意义序列对照组，转染miR-1224-5p模拟物组，转染miR-1224-5p抑制物阴性对照组及转染miR-1224-5p抑制物组。运用实时荧光定量PCR验证转染模拟物及抑制物后各组细胞中miR-1224-5p的表达水平是否符合实验要求。通过CCK-8及EdU实验检测各组成纤维细胞增殖能力，Transwell实验检测各组成纤维细胞侵袭能力，流式细胞仪检测各组成纤维细胞凋亡情况。运用Western Blot技术检测与细胞增殖及凋亡相关分子caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白水平变化，并通过实时荧光定量PCR及Western Blot检测TGF-β1、Smad3的RNA及蛋白水平变化。 结果（1）CCK-8实验结果显示瘢痕疙瘩成纤维细胞转染miR-1224-5p模拟物组72h 生长速度明显滞后于对照组及模拟物无意义序列对照组，差距有统计学意义（P<0.05）；瘢痕疙瘩成纤维细胞转染miR-1224-5p抑制物组在72 h生长速度明显快于抑制物阴性对照组，差距有统计学意义（P<0.05）；（2）EdU 实验显示瘢痕疙瘩成纤维细胞转染miR-1224-5p模拟物组细胞内细胞核减少，DNA的复制活性明显降低，并且将 EdU 阳性细胞所占百分比进行统计：对照组及模拟物无意义序列对照组分别为 41.2%、45.1%，而 miR-1224-5p 模拟物组为 21.0%，百分占比明显减低，差距有统计学意义（P<0.05），抑制物阴性对照及miR-1224-5p抑制物组分别45.9%及86.2%，转染抑制物组明显升高，差距有统计学意义（P<0.05）；（3）运用流式细胞仪检测各组瘢痕疙瘩成纤维细胞的凋亡情况，对照组、转染模拟物无意义序列对照组、转染miR-1224-5p模拟物组、转染miR-1224-5p抑制物阴性对照组及转染miR-1224-5p抑制物组凋亡率分别为 9.92±0.42%， 10.12±0.24%、15.81±0.31%、10.78±0.46%、5.93±0.37%。miR-1224-5p mimic（模拟物）组较对照组、转染模拟物无意义序列对照组及转染 miR-1224-5p 抑制物阴性对照组细胞凋亡率较明显升高，而 miR-1224-5p inhibitor（抑制物）组较对照组、转染模拟物无意义序列对照组及转染 miR-1224-5p抑制物阴性对照组细胞凋亡率明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；（4）Transwell小室结果显示瘢痕疙瘩成纤维细胞对照组及模拟物无意义序列对照组细胞转移到小室下壁的细胞数目相同，明显多于瘢痕疙瘩成纤维细胞miR-1224-5p模拟物组，差距有统计学意义（p<0.05）。相反的是，转染 miR-1224-5p 抑制物组细胞数少于抑制物阴性对照组（p<0.05）；（5）Western blot实验结果显示与瘢痕疙瘩成纤维细胞未处理组及无意义序列对照组相比，瘢痕疙瘩成纤维细胞miR-1224-5p模拟物组caspase-3、Bax的蛋白水平明显上调，并且Bcl-2，TGF-β1及Smad3的蛋白水平明显下调；而相反的是，相对于转染抑制物阴性对照组，转染miR-1224-5p抑制物组caspase-3及Bax的蛋白水平明显表达增强，Bcl-2的蛋白水平明显表达减弱；（6）实时荧光定量PCR实验结果提示转染 miR-1224-5p 模拟物组，与未处理组及无意义序列对照组相比， TGF-β1及Smad3的RNA水平表达下调，差异有统计学意义（p<0.05）；与抑制物阴性对照组相比，转染miR-1224-5p抑制物组TGF-β1及Smad3的RNA水平表达上调，差异有统计学意义（p<0.05）。 结论 miR-1224-5p 的模拟物能够抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、侵袭，促进瘢痕疙瘩成纤维细胞的凋亡；miR-1224-5p的抑制物能够促进瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、侵袭，抑制其凋亡。miR-1224-5p 调控 caspase-3、Bcl-2 及 Bax 的表达，并受TGF-β1/Smad3信号通路调控。预示着miR-1224-5p可作为瘢痕疙瘩靶向治疗的潜在靶点。

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