携带EGFP基因的逆转录病毒载体的构建及初步应用

摘要

[目的]构建携带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的逆转录病毒载体,观察GFP的表达情况以及对靶细胞生物特性的影响.[方法]以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应,获得完整保留pEGFP-C1载体多克隆酶切位点(MCS)的EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP,转染PA317包装细胞后获得具有感染能力的病毒颗粒,转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2,通过荧光显微镜和流式细胞仪(FACS)观察EGFP做为报告基因在体外的表达情况、以及对靶细胞生物特性的影响.[结果]成功克隆携带有EGFP基因的逆转录病毒载体,该载体经包装细胞包装后可有效转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2并稳定表达,对靶细胞的生长无抑制.高表达FP的靶细胞形态变得细长,FACS检测约有98%的细胞表达GFP,体外培养6个月荧光强度没有明显的衰减.而低表达GFP的靶细胞形态无变化,FACS检测有30%细胞表达GFP.[结论]使用GFP作为报告基因,检测到的病毒载体转染率比实际偏低,所构建的pLXSN-EGFP载体可在体外稳定表达,为再插入治疗用基因进行后续研究奠定基础.