肠上皮细胞中大肠杆菌侵袭素IbeA结合蛋白的分离

摘要

目的 分离肠上皮Caco-2细胞中与IbeA相互作用的蛋白.方法 表达并纯化重组IbeA,将1、5、10 μg/ml的His-IbeA及牛血清白蛋白与Caco-2单层细胞4℃孵育30min后.在37℃利用庆大霉素保护实验测定各组大肠杆菌K1致病株E44侵袭率的变化.裂解Caco-2得全细胞蛋白,上样至结合有His-IbeA的金属离子螫和柱,His pull down纯化特异性结合蛋白,电泳分析,Far-Western blotting进行两者结合特异性的验证.并分析结合蛋白N末端氨基酸序列.结果 重组IbeA阻断E44侵袭Caco-2,并呈一定剂量依赖关系,对照组BSA对侵袭没有显著影响.His pull down的方法纯化出两个结合条带,Far-Western blotting验证了结合的特异性.并测定强结合条带pI约5.0,N端序列为MASITKLP.结论 分离得到两个与IbeA相互作用的蛋白,为研究IbeA分子致病机制奠定了基础.