瑶山亚种树鼩IFN-β和IFN-γ原核表达及其多克隆抗体制备

摘要

【目的】构建瑶山亚种树鼩IFN-β和IFN-γ基因原核表达载体,并制备IFN-β和IFN-γ多克隆抗体,为进一步研究树鼩病毒感染动物模型打下基础。【方法】以瑶山亚种树鼩外周淋巴细胞为原材料,提取总RNA后经RT-PCR扩增瑶山亚种树鼩IFN-β和IFN-γ基因,亚克隆至质粒pcDNA3.1(+)上构建真核表达载体,并瞬时转染仓鼠肾细胞(BHK 21);同时亚克隆到原核载体pET-28a(+)上构建原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后以IPTG诱导表达融合蛋白IFN-β和IFN-γ。融合蛋白纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体,并利用Western blotting和间接免疫荧光(IFA)检测分析其反应性。【结果】扩增获得的瑶山亚种树鼩IFN-β和IFN-γ基因片段分别为564和501 bp,亚克隆至质粒pcDNA3.1(+)上成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-IFN-β和pcDNA3.1-IFN-γ,亚克隆到原核载体pET-28a(+)上成功构建获得原核表达载体pET-28a-IFN-β和pET-28a-IFN-γ。原核表达载体pET-28a-IFN-β和pET-28a-IFN-γ转化BL21(DE3)感受态细胞后在30℃下以0.5 mmol/L IPTG诱导6 h即获得融合蛋白IFN-β和IFN-γ,且融合蛋白主要以包涵体形式表达,以含2 mol/L尿素的洗涤液洗涤后可获得纯度相对较高的融合蛋白,且损失较少。纯化的融合蛋白IFN-β和IFN-γ经乳化后免疫小鼠,成功制备获得IFN-β和IFN-γ多克隆抗体,Western blotting和IFA检测结果均显示这2个多克隆抗体具有良好的反应性。【结论】通过原核表达系统可在大肠杆菌中成功诱导表达获得瑶山亚种树鼩IFN-β和IFN-γ,复性后的融合蛋白具有良好的反应性和免疫原性,免疫小鼠制备获得的多克隆抗体反应性良好且抗体效价高,可作为检测工具用于研究瑶山亚种树鼩病毒感染模型。