一株侵染掌叶半夏的大豆花叶病毒的全基因组序列测定和vsiRNA特征分析

摘要

【目的】探究侵染掌叶半夏(Pinellia pedatisecta)的大豆花叶病毒(Soybean mosaicvirus,SMV)衍生的干扰小RNA(virus-derivedsmallinterferingRNA,vsiRNA)序列特征,为掌叶半夏抵御病毒的作用机制研究提供参考。【方法】以一株来自广西的具有典型病毒病症状的掌叶半夏为材料,取其褪绿斑驳的叶片采用TRIzol法提取总RNA,并进行小RNA深度测序(Small RNADeepSequencing);利用快速扩增cDNA末端(Rapid AmplificationofcDNAEnds,RACE)和分段克隆技术获得病毒的全长基因组序列,利用MEGA 7.0将其与有代表性的病毒序列构建系统发育进化树并分析亲缘关系;以克隆测序获得的基因组序列作为参考进行vsiRNA特征分析。【结果】小RNA深度测序共获得4851249条高质量的读段(reads),长度为21、22和24 nt的reads具有较高的丰度,占比分别为33.4%、13.7%和11.3%。该病毒分离物的基因组全长为9735 nt,编码3105个氨基酸,其基因组全序列与SMV HZ1分离物核苷酸序列相似性为86.93%,暂命名为SMV NN;系统发育进化树显示,SMV NN与分离自半夏的SMV HZ1分离物的亲缘关系最近。将vsiRNA定位到克隆测序后获得的SMV NN的基因组上,分析该病毒的vsiRNA特征,结果发现长度为21和22 nt的vsiRNA具有较高的丰度,病毒全基因组的正链和负链均能被vsiRNA覆盖,且分别在HC-Pro和P3蛋白编码区具有最强热点。【结论】掌叶半夏主要通过dicer样核糖核酸酶4(dicer-likeribonuclease 4,DCL4)和Argonaute蛋白1(Argonaute1,AGO1)对SMV的HC-Pro和P3蛋白编码区进行剪切,主要产生长度为21和22 nt的vsiRNA,从而抑制SMV在植株体内的复制。