桂糖11号Rubisco基因克隆、原核表达及纯化

摘要

【目的】通过原核表达及纯化获得甘蔗1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）的大、小亚基融合蛋白,为获得符合抗体制备条件的高纯度融合蛋白提供技术支持。【方法】以甘蔗品种桂糖11号（GT11）＋1叶为材料,根据NCBI公布的甘蔗Rubisco大、小亚基基因（rbc L和rbc S）的编码域序列（CDS）设计特异性引物,PCR扩增rbc L和rbc S基因的CDS,然后连接至原核表达载体p ET-30a（＋）,构建重组质粒后转入原核细胞（大肠杆菌Rosetta）中诱导表达,用镍亲和层析柱对融合蛋白进行纯化,并比较分析桂糖11号与其他甘蔗品种在rbc L和rbc S基因的CDS及编码蛋白序列方面的差异。【结果】rbc L和rbc S基因的CDS长度分别为1431和510 bp,其中桂糖11号rbc L基因的CDS与Saccharum hybrid cultivar SP80-3280（Gen Bank登录号AE009947）、Saccharum hybrid cultivar Q155（Gen Bank登录号KU214867）的一致,桂糖11号rbc S基因的CDS与Saccharum hybrid cultivar GT28（Gen Bank登录号JN591757）的存在7个碱基差异,但仅有2个氨基酸发生错义突变。Rbc L和Rbc S融合蛋白以包涵体形式存在原核细胞中,用镍离子亲和层析纯化及超滤浓缩后其浓度均在1.0 mg/m L以上。【结论】从桂糖11号成功克隆Rubisco大亚基和小亚基基因的CDS,大亚基基因的CDS比小亚基的保守性更高,且均可在原核细胞中高度表达,经纯化浓缩获得的高纯度融合蛋白可用于制备Rubisco单克隆抗体。