大鼠Eap1-shRNA慢病毒干扰载体的构建及细胞水平阻断Eap1对Kiss1表达的影响

摘要

目的·构建大鼠Eap1-shRNA慢病毒干扰载体,观察在细胞阻断Eap1基因表达对Kiss1基因表达的影响。方法·针对大鼠Eap1基因mRNA序列设计4条shRNA干扰序列及1条阴性对照序列,序列合成后连接至LV3质粒构建重组慢病毒质粒载体。经鉴定正确后,与包装质粒pGag/Pol、pRev、p VSV-G共同转染293T细胞进行慢病毒包装并测定病毒滴度。将构建好的慢病毒感染NRK-52E细胞,感染72 h后收集细胞,采用real-time PCR及Western blotting技术检测Eap1基因mRNA和蛋白表达水平的变化。筛选出干扰效果最佳的干扰慢病毒再次感染NRK-52E细胞(设置空白对照和阴性对照),感染72 h后检测Kiss1 mRNA表达水平的变化。结果·NRK-52E细胞感染72 h后,阴性对照慢病毒与空白对照组相比,Eap1 mRNA及蛋白的表达量均无明显差异,而各干扰病毒组Eap1 mRNA及蛋白的表达量均显著降低,且以慢病毒Eap1-shRNA4干扰效果最佳。阻断NRK-52E细胞Eap1基因表达后,与对照组相比,其Kiss1 mRNA表达水平明显增高。结论·成功构建大鼠Eap1-shRNA慢病毒表达载体;阻断NRK-52E细胞Eap1基因表达后,Kiss1表达水平下降。