SMAD2和SMAD3在人胚胎干细胞分化过程中的不同调控作用

摘要

目的·探究转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGFβ)家族下游的关键转录因子SMAD蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein)——SMAD2和SMAD3在人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)体外分化过程中的不同作用。方法·在hESC中,通过蛋白质印迹法(Western blotting)检测SMAD2和SMAD3在分化过程中的蛋白表达水平。通过CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)技术构建SMAD2敲除(SMAD2 knockout,SMAD2KO)和SMAD3敲除(SMAD3 knockout,SMAD3KO)的细胞系。利用免疫荧光染色检测SMAD蛋白丢失对多能性因子八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor 4,OCT4)和性别决定区Y框蛋白2(sex determining region Y-box 2,SOX2),神经外胚层(neuroectoderm,NE)标志因子配对盒因子6(paired box 6,PAX6)和性别决定区Y框蛋白1(sex determining region Y-box 1,SOX1)以及中内胚层(mesendoderm,ME)标志因子SOX17的表达影响;同时使用流式细胞术鉴定SMAD2敲除或SMAD3敲除对NE标志因子PAX6以及ME标志因子SOX17、脱中胚蛋白(eomesodermin,EOMES)和C-X-C模体趋化因子受体4(C-X-C motif chemokine receptor 4,CXCR4)表达的影响。在SMAD2KO和SMAD3KO细胞中分别过表达SMAD2和SMAD3质粒,通过Western blotting检测SMAD2和SMAD3蛋白回补的效果,并利用实时定量PCR(real-time quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)检测SMAD蛋白回补后对分化过程中的ME关键因子EOMES、叉头框转录因子A2(forkhead box A2,FOXA2)和GSC同源盒(goosecoid homeobox,GSC)表达的影响。结果·虽然SMAD2和SMAD3的蛋白序列较为相似,但是SMAD2才是hESC中主要表达的蛋白因子。免疫荧光染色结果表明,SMAD2敲除和SMAD3敲除并不会影响hESC多能性因子OCT4和SOX2的表达;同时流式细胞术发现,SMAD蛋白的缺失也不会影响NE标志因子PAX6和SOX1的表达。SMAD3敲除对hESC向ME分化没有显著的影响,而SMAD2敲除严重阻碍了hESC表达ME标志因子SOX17、EOMES和CXCR4。通过qRT-PCR检测显示在SMAD2KO细胞中过表达外源性SMAD2可以有效地恢复ME基因EOMES、FOXA2和GSC的表达,而在SMAD3KO细胞中回补SMAD3对这些ME基因的表达无影响。结论·SMAD2和SMAD3在hESC向ME分化过程中的调控作用不同。SMAD2而非SMAD3是决定hESC表达ME基因的关键。