布鲁菌M5侵染小鼠骨髓源性树突状细胞后抗原肽的筛选

摘要

[目的]用绿色荧光标记的布鲁菌M5菌株(GFP-M5)侵染小鼠骨髓源性树突状细胞,对成熟树突状细胞表面主要组织相容性复合物Ⅱ(MHCⅡ)类分子结合的多肽进行筛选.[方法]用联合细胞因子重组小鼠GM-CSF和IL-4诱导小鼠骨髓单个核细胞向树突状细胞定向分化和增殖,于诱导培养的第1,3,5,7天在倒置荧光显微镜下观察细胞的形态学变化;用PE标记的CD11c抗体和FITC标记的CD80抗体对培养第7天的小鼠骨髓源性树突状细胞进行标记,流式细胞仪检测树突状细胞表面因子表达情况;用GFP-M5侵染培养第7天的小鼠骨髓源性树突状细胞24 h,激光共聚焦显微镜下观察菌株侵染情况;采用免疫共沉淀技术从树突状细胞膜水溶性蛋白溶液中分离纯化MHCⅡ-免疫多肽组复合物,C18固相萃取柱纯化小分子多肽,应用高效毛细管电泳(HPCE)和液相色谱-二级质谱(LC-MS/MS)联用技术进行纯化和测序,在布鲁菌基因组数据库中对质谱测试原始数据进行检索,筛选与布鲁菌M5基因组匹配的MHCⅡ类结合序列所代表的蛋白质.[结果]倒置荧光显微镜下观察细胞生长状态发现,小鼠骨髓源性树突状细胞由最初表面光滑无突起的圆形细胞(第1天)转变为表面突起明显增多的典型树突状细胞(第7天);经流式细胞仪检测发现,培养第7天的树突状细胞CD11c阳性率为72.0％,CD80阳性率为8.4％,符合未成熟树突状细胞表面标志物的特征.GFP-M5侵染细胞24 h后在激光共聚焦显微镜下可观察到大部分树突状细胞已完全被侵染,即成为成熟树突状细胞;免疫共沉淀结合LC-MS/MS技术,从经GFP-M5侵染的3组树突状细胞膜水溶性蛋白溶液中分离出了800多个MHCⅡ分子提呈的多肽分子,经与布鲁菌全基因组比对,属于布鲁菌且在3个试验重复中至少重复出现2次的有28个多肽序列;蛋白质鉴定表明,这些短肽包括布鲁菌外膜蛋白和外膜蛋白组装过程中需要的相关酶类,以及在抗原递呈过程中细胞内一系列生化反应所需的酶类.[结论]建立了外源性抗原体外侵染树突状细胞,获得了一系列布鲁菌M5菌株侵染小鼠骨髓源性树突状细胞后的MHCⅡ免疫多肽.