牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ的原核表达与纯化

摘要

【目的】建立牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ(Vaccinia topoisomeraseⅠ)的原核表达体系及纯化方法,以获得高活性、高纯度的牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ。【方法】优化并人工合成牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ的全基因序列,构建牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ的原核表达载体(pET28a/TOPO)并转化E.coliBL21 Star(DE3)菌株,优化其诱导表达条件,表达蛋白经Talon his-tag purification resin螯合层析柱纯化,用SDS-PAGE鉴定纯化效果,借助酶切质粒pLLP-OmpA检测纯化蛋白的活性。【结果】转化pET28a/TOPO的E.coliBL21 Star(DE3)特异地表达了牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ蛋白,最佳诱导条件为30℃下以0.5 mmol/L IPTG诱导12 h。该蛋白经钴离子螯合层析柱纯化后,SDS-PAGE电泳结果显示其为分子质量36 ku的蛋白。酶切和冻融试验结果表明,该酶具有高活性和高稳定性。【结论】成功构建了牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ的原核表达和纯化体系,为后续拓扑异构酶Ⅰ的应用研究奠定了基础。