卵泡液微环境对人羊水干细胞体外分化为雌性生殖细胞的影响

摘要

目的观察不同直径猪卵泡内卵泡液诱导人羊水干细胞(human amniotic fluid stem cells,hAFSCs)-070607株向雌性生殖细胞分化的效果。探讨卵泡内微环境对体外雌性生殖细胞形成的影响。方法选取不同直径猪卵泡内的卵泡液(S组:直径6 mm),检测卵泡液内雌二醇(E2)和卵泡刺激素(FSH)的含量及骨形态发生蛋白15(BMP15)的表达。将不同分组卵泡液添加到雌性生殖细胞分化体系中,经过5 d的体外诱导培养,观察生殖细胞基因OCT4、FIGLα、GDF9、FSHR和甲基化基因DNMT3B的表达变化。继续用M组卵泡液诱导hAFSCs-070607,观察基因及蛋白表达的变化。结果通过基因、蛋白和三胚层分化的检测,确定hAFSCs-070607具有良好的多能性及分化潜能。3组不同直径的卵泡液内都含有FSH,但不含E2;BMP15的未成熟蛋白在M组中的含量略高于S、L组。M组添加到诱导分化培养基后,E2的产量较高,生殖相关标记基因检测结果发现,OCT4、FIGLα、GDF9、FSHR和DNMT3B基因的表达依次按照大、中、小卵泡组上升。继续用M组卵泡液诱导hAFSCs-070607,诱导10d后,有卵母细胞样细胞(oocyte-like cells,OLCs)和卵泡样结构的出现,经EGFP-BMP15转染后,这些结构显示EGFP表达阳性,表明有OLCs的产生。荧光定量PCR结果证实,生殖细胞形成相关基因OCT4、FIGLα、GDF9、FSHR和表观学基因DNMT3B的表达逐渐呈上升的趋势。经细胞免疫荧光技术检测发现,生殖相关蛋白OCT4、FRAGILIS和SCP3呈阳性表达。结论hAFSCs-070607株人羊水干细胞具有良好的多能性和体外分化潜能,经猪卵泡液体外诱导分化后,可分化为雌性生殖细胞,且M组卵泡液诱导后细胞分泌的E2高于S组和L组。长时间诱导后,生殖细胞相关基因和蛋白上调,并能形成卵泡样结构。