高亲和力抗eGFP纳米抗体的筛选与应用

摘要

将增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,eGFP)免疫羊驼后构建纳米抗体免疫库,固相淘选eGFP纳米抗体;构建E.coli Rosetta表达载体,诱导表达纳米抗体,并鉴定其结合活性及特异性;辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)标纳米抗体,确定其工作浓度及稳定性;将纳米抗体与纳米磁珠偶联应用于免疫沉淀B13-EGFP融合蛋白.四免后抗血清滴度超过1.28×106,获得库容量为1.85×108 cfu的抗eGFP纳米抗体噬菌体展示文库;原核表达10种独特基因序列的纳米抗体,均为可溶性表达;采用ForteBio Octet确定出纳米抗体4-28与eGFP的亲和常数(KD)最高,达到9.67×10-11 M;纳米抗体4-28与eGFP、绿色荧光蛋白(Green Fluo-rescent Protein,GFP)特异性结合;HRP标记纳米抗体4-28检测范围是1:10000～1:25000(浓度100～40 ng·mL-1),比市场上现有的检测二抗(稀释范围1:5000～1:20000)灵敏度更高;纳米抗体4-28偶联羧基化纳米磁珠,免疫沉淀B13-eGFP融合蛋白,实现了简单快速分离目的蛋白B13-eGFP.