t-PA昆虫细胞表达及特性分析

摘要

应用RT-PCR技术,从人黑色素瘤Bowes细胞株中扩增出人组织型纤溶酶原激活剂(tis-sue-type plasminogen activator,t-PA)cD-NA。序列分析证实,与国外的报道完全一致。将含完整阅读框架的人t-PA cDNA克隆至昆虫细胞表达转移载体pBacPAK8中,获得重组质粒pBac-tPA。应用脂质体共转染法,将pBac-tPA和线性化杆状病毒BacPAK6 DNA共转染Tn-5B-1昆虫细胞。经空斑筛选获得11株重组病毒。经PCR鉴定与生物活性测定,获得一株高效表达t-PA的重组病毒BactPA3。在含胎牛血清的培养基中,t-PA表达活性在感染(MOI≈10)后72h左右达到最高,为3.04×10~3IU/ml,即相当于1.8×10~4IU/10~6细胞;在无血清培养基中,t-PA最高表达水平相差不大,但时间为感染后132h左右。经SDS-PAGE纤维蛋白自显影分析,分子量为68kDa左右。与从人黑色素瘤细胞培养液中提纯的天然t-PA相比,其受纤维蛋白原激活的特性、和纤维蛋白的亲和力及在血浆中的失活速率基本相同。表达的t-PA在血液循环中的半衰期为7min。