人canstatin基因原核载体构建及其重组蛋白的表达纯化

摘要

目的:构建人血管能抑素canstatin基因原核表达载体,表达并纯化出其重组蛋白.方法:从人胎盘组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增canstatin cDNA,克隆进质粒pUCm-T,转化E coli DH5α,测序正确后,酶切目的基因片段,插入质粒pET-22b(+),转化E.coli BL21,IPTG诱导蛋白表达,Ni-NTA柱亲和层析纯化重组蛋白.结果:电泳证实RT-PCR扩增产物与预期目的基因canstatin长度一致.RT-PCR纯化产物与载体pUCm-T连接后,经蓝白斑筛选,挑出6个白色菌落做酶切鉴定.其中一个菌落被证实为阳性克隆,测定其基因序列,结果显示与Genbank公布的canstatin基因序列完全一致.将canstatin cDNA,插入质粒pET-22b(+),转化E.coli BL21,培养过夜后,挑选7个白色菌落做酶切鉴定,证实均为阳性克隆.IPTG诱导其中一个克隆表达蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明,在相对分子质量24000左右出现新的蛋白表达条带,诱导1、2、3、4 h后,表达蛋白分别占菌体总蛋白的18.2%、18.8%、23.0%和23.4%.将诱导3 h的菌体超声破碎后,Ni柱亲和层析,125和250 mmol/L咪唑洗脱液SDS-PAGE电泳显示出清晰的单一条带.结论:成功构建人canstatin基因原核表达载体,表达并纯化出canstatin重组蛋白,为深入研究其临床应用打下基础.