丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT2的体外激酶活性分析

摘要

目的 建立蛋白激酶AKT2体外磷酸化检测体系.方法 构建携带AKT2 cDNA编码区的pLNCX2逆转录病毒重组载体,包装重组病毒,转导293A细胞,G418筛选得到稳定表达组成型活化的AKT2细胞株,应用免疫沉淀获得蛋白激AKT2;将核基质结合蛋白SATB1的1～204的氨基酸序列及其47位丝氨酸的突变体S47A、S47D,分别与GST基因融合表达载体pGEX4T-1进行重组,经测序鉴定后转化大肠埃希菌BL-21,IPTG诱导表达经亲和纯化得到GST-SATB1 1-204、GST-SATB1 1-204 S47A和GST-SATB1 1-204 S47D融合蛋白;利用免疫沉淀的AKT2磷酸化GST-SATB1融合蛋白,应用免疫印迹检测其是否被磷酸化.结果 细胞表达的蛋白激酶AKT2能高效的将野生型SATB1 1-204 磷酸化,而不能磷酸化其两种突变体.结论 成功建立了一个蛋白激酶体外磷酸化系统.