attB位点核心区定点突变对φC31整合酶效率的影响

摘要

目的考察attB位点核心区碱基突变对φC31整合酶存真核细胞中催化目的基网整合效率的影响。方法选取attB位点核心区中可能对中c31整合酶效率产生影响的碱基，设计含有相应位点突变的引物，采用大引物法两轮PCR扩增得到含突变碱基的attB片段，将其连人含报告基因的载体pEGFP。NI中得到pEGFP—NI—attB。以含野生型attB位点的报告基因载体pEGFP-N1-attB作为对照．将上述载体分别与中φC31整合酶表达质粒共转染HeLa细胞，经过药物筛选、染色、细胞克隆计数后，计算并比较整合效率。结果成功完成9个含有突变碱基attB位点及报告基因载体的构建。酶切及测序鉴定结果显示每个质粒含1或2个突变碱基。其中6个质粒为目标碱基突变，3个为PCR过程中随机产生的非预期突变。细胞实验结果表明，3个含有突变attB报告质粒的整合率与野生型attB相比无显著性差异，其余6个突变attB报告质粒的整合率与野生型attB相比显著降低（P〈0．05），尤其是其中两个attB位点中含有2个碱基突变的报告质粒，整合率降低极为显著（P〈0．001）。结论attB位点核心区碱基保守性较强，其中一些关键位点的突变使得整合酶效率降低。