Sau MurA的表征及依布硒啉对Sau MurA和金黄色葡萄球菌的抑制作用

摘要

目的 对金黄色葡萄球菌UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮转移酶(Staphylococcus aureus UDP-N-acetylglucosamine enolpyruvyl transferase,Sau MurA)酶学特性和活性位点进行表征,探究依布硒啉对Sau MurA和金黄色葡萄球菌的抑制作用。方法 构建Sau MurA表达系统,利用亲和层析方法纯化MurA蛋白,通过孔雀石绿检测法对其活性进行鉴定,并对其酶学特性进行分析;利用定点突变方法对MurA的6个特定氨基酸位点进行突变,构建突变蛋白表达体系,确定MurA活性位点。利用依布硒啉对Sau MurA和金黄色葡萄球菌及其成熟生物膜进行处理,探究依布硒啉的抑制作用。结果 确定了Sau MurA具有UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮转移酶活性,在37℃和pH=7.5时表现出最大活性。UDP-N-乙酰葡萄糖胺(UDP-N-Acetyl-glucosamine enolpyruvyl transferase, UNAG)的Km为(0.238±0.043)mM,磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate, PEP)的Km为(0.531±0.046) mM。6个Sau MurA突变蛋白均无活性。依布硒啉对Sau MurA和金黄色葡萄球菌均有抑制作用,半抑制浓度(IC_(50))和最小抑制浓度(MIC)分别是4.9μM,4.28μg/mL。当药物浓度为4×MIC,明显抑制细菌的生长。对于成熟生物膜的抑制作用,16×MIC依布硒啉的抑制率约为80%,相同浓度下的利福平抑制率约为40%。结论 Sau MurA在37℃和pH=7.5时表现出最大活性,具有较低的底物亲和力。确定K22,N23,C119,R124,D308,R400是Sau MurA重要的活性位点。依布硒啉抑制Sau MurA的活性和金黄色葡萄球菌的生长,并有效地去除金黄色葡萄球菌的成熟生物膜。