木糖氧化产碱菌中亚硝酸盐还原酶基因的克隆与表达

摘要

目的:对木糖氧化产碱菌中亚硝酸盐还原酶基因(nir)进行克隆并表达,并测定酶的活力,探讨亚硝酸盐还原酶(NiR)对亚硝酸盐的降解特性.方法:提取木糖氧化产碱菌DNA,根据GenBank公布的nir基因序列设计引物,利用PCR技术扩增nir基因,克隆至表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28a-nir,通过双酶切和测序鉴定后,将阳性重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,获得重组蛋白.将细胞发酵液超声破碎,提取粗酶,测定酶活力.结果:经PCR扩增及测序鉴定得到长度为1 083 bp的目的片段；经终浓度0.6 mmol·L-1 IPTG、30℃诱导表达5h,获得相对分子质量为37 000的重组蛋白；在pH6.5、反应温度35℃时,测得酶活力为51.74U·mL-1.结论:成功克隆nir基因,在大肠杆菌BL21 (DE3)中获得表达,且表达产物有酶活.