人参尖镰孢菌原生质体制备条件优化及绿色荧光蛋白转化

摘要

为人参根腐病菌的侵染及防治提供可视化的检测和分析手段,通过摸索分生孢子最适萌发时间、酶解液组成、酶解温度、摇床转数及渗透压稳定剂种类,研究人参根腐病菌-尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)原生质体制备技术.结果 表明:将人参尖镰孢菌野生型菌株0083分生孢子在YEPD培养基中培养11h,酶解温度37°C、摇床转数180 r/min,渗透压稳定剂为0.7 mol/L NaC1的条件下,酶解液(崩溃酶、溶菌酶、纤维素酶和蜗牛酶质量浓度分别为0.01,0.03,0.02,0.005 g/mL)酶解0.25 g菌丝时,收获的菌丝体最有利于原生质体的形成和释放,共获得2.8× 107/mL原生质体.用聚乙二醇PEG介导外源DNA随机插入的方法,成功获得具有绿色荧光信号和潮霉素B筛选标记的转化子,转化效率(以单位质量的DNA的转化子数计)为1400/mg.选取转化子FOG1菌株经过6代继代培养后,菌落形态、产孢量和绿色荧光蛋白的表达与菌株0083无明显差异.因此,利用聚乙二醇(PEG)为媒介的遗传转化体系是稳定高效的遗传转化体系.