绿色荧光蛋白标记的椰子茎泻血病菌原生质体的制备方法

摘要

本发明属于分子植物病理学领域，具体涉及一种绿色荧光蛋白标记的椰子茎泻血病菌原生质体的制备方法。本发明确定了形成原生质体的合适条件，选择以1mol/L的甘露醇为稳渗剂，以7.5mg/mL的崩溃酶为裂解酶，制备高质量的原生质体，并将GFP转入到椰子茎泻血病菌，获得稳定遗传的GFP病原菌菌株，为该病菌的GFP转化、基因表达等遗传操作夯实基础，且节约成本，并能大大提高工作效率，缩短研究时间。同时，绿色荧光蛋白标记后的椰子茎泻血病菌便于该病害进行组织病理学和病害流行学等方面的研究。

说明书

技术领域

本发明属于分子植物病理学领域，具体涉及一种绿色荧光蛋白标记的椰子茎泻血病菌原生质体的制备方法。   

背景技术   

椰子茎泻血病（coconut stem bleeding disease）在我国尤其在海南发生越来越严重，在琼海，万宁，屯昌一带发病率有逐年上升的趋势。该病主要危害椰子茎基部，在病灶部位有铁锈状液体流出，严重影响观赏价值，最终导致植物死亡；也危害果实，使果实变黑脱落，使得椰果产量严重降低，给海南人民带来了很大的经济损失。其病原是奇异长喙壳菌（Ceratocystis paradoxa）的无性世代奇异根串珠霉菌（Thielaviopsis paradoxa ）。

绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein,简称GFP）是1962年在美国西海岸所盛产的水母中发现的一种蛋白质，它不仅无毒，而且不必借助其他辅酶就能自身发光，标记了GFP，就可以在分子水平上研究活细胞的动态过程。

将GFP转入到椰子茎泻血病菌，获得稳定遗传的GFP病原菌菌株，为进一步研究该病原菌的侵染方式、扩展过程、传播途径等提供了保障，为该病害的防治奠定了基础。

原生质体的制备是进行遗传转化的前提和关键，对病菌进行遗传转化，构建病菌的突变体，是探讨致病机制，克隆致病基因，寻找控制该病害的有效途径。原生质体转化法与根癌农杆菌介导转化（REMI）、电击转化、限制性内切酶转化（ATMT）、基因枪法相比，不受限于昂贵的仪器设备，只需简单常规的仪器，操作简便易行。由于不同种、属真菌细胞壁的组分差异，因此酶解细胞壁的酶、所用酶量、菌丝的培养时间、所需稳渗剂等不尽相同，制备高质量的原生质体可以提高转化效率与实验成功率的保障。

发明内容

本发明的目的在于提供一种绿色荧光蛋白标记的椰子茎泻血病菌原生质体的制备方法，为该病菌的GFP转化、基因表达等遗传操作夯实基础，且节约成本，并能大大提高工作效率，缩短研究时间。

本发明采取的技术方案包括以下步骤：

步骤一：将椰子茎泻血病菌菌块接种到CM培养基上26℃培养24h,然后研磨菌丝接种到液体酵母淀粉培养基震荡培养，转速120rpm,26℃培养36h，用灭菌的微细绒布过滤菌丝，然后用无菌水冲洗菌丝，再用1mol/L的甘露醇充分洗涤，用灭菌滤纸吸干水分；

步骤二：用已灭菌三角瓶盛装已过滤除菌的7.5mg/mL崩溃酶液10mL和1.0g步骤一中洗涤并吸干的菌丝，用枪头轻轻吸打吹散均匀，将该三角瓶放入31℃恒温培养箱震荡培养1小时 -4h，转速90rpm，结束后，用三层灭菌的微细绒布过滤菌液于离心管中，转速4000rpm、4℃、离心10min，弃上清，用20mLSTC轻轻吸打混匀，进行二次离心，弃上清，以1mL-3mLSTC溶解即可得到6.15×10⁸-3.05×10⁹个/mL的原生质体悬液，再加入10%的DMSO,分装，150μL /管，置于-80℃冰箱保存；其中所述崩溃酶液以1mol/L的甘露醇配制；

步骤三：取2μg 绿色荧光蛋白pCT74-sGFP质粒，转入步骤二150μL原生质离心管中,轻轻弹匀，静止30min,加600μL PTC混匀，静止20min,加入6mL TB3溶液，于26℃、90rpm复苏12h，然后将复苏液倒入100mL、45～55℃含40-100μg/ml潮霉素B的TB3固体培养基中混匀，26℃倒置培养3-4天，连续转接3代到含40-100μg/ml 潮霉素B的PDA培养基上筛选性状稳定的转化子，再连续培养4代在无潮霉素B的PDA培养基上以确保其遗传稳定性，即获得了具有绿色荧光蛋白标记的椰子茎泻血病菌菌株；

以上试剂及培养基配制如下：（1）液体酵母淀粉培养基：酵母粉2 g/L，可溶性淀粉10 g/L，蔗糖3g/L；（2）STC：1.2M山梨醇,50mM Tris-Cl、pH8.0,50mM CaCL₂；（3）PTC：40%聚乙二醇3350，1.2M山梨醇,50mM Tris-Cl、pH8.0,50mM CaCL₂；（4）TB3溶液即TB3培养基：蔗糖200 g/L，酸水解酪蛋白6 g/L，酵母提取物6 g/L；TB3固体培养基：含1.5%琼脂粉的TB3培养基。

本发明一种椰子茎泻血病菌的原生质体的制备方法，其意义在于：确定了适宜原生质体形成的条件，为椰子茎泻血病菌原生体转化，基因表达等遗传操作奠定了基础，且大大缩短了研究时间，提高了工作效率。同时，绿色荧光蛋白标记后的椰子茎泻血病菌便于该病害进行组织病理学和病害流行学等方面的研究。

附图说明

图1为以甘露醇为稳渗剂，以崩溃酶液裂解1小时30min后椰子泻血病菌原生质体在20ⅹ物镜下的效果图。

图2为PCR验证图，其中1-8代表8个转化子，9为阴性对照（以椰子泻血病菌野生菌株DNA进行扩增），10为阳性对照（以pCT74-sGFP质粒进行PCR扩增），所用引物为ToxAsGFPF:  5'  TGGAATCCATGGAGGAGTTC  3'；ToxAsGFPR:  5'  CTTGTACAGCTCGTCCATGC  3'。

图3为带有GFP荧光蛋白标记的菌株荧光效果图，椰子泻血病菌的菌丝和孢子被标记为绿色。

具体实施方式

为了进一步阐述该发明一种椰子茎泻血病菌原生质体的制备方法，举例如下

实施例一

1 病原菌对潮霉素B的抗性检测

设潮霉素B的浓度分别为10μg /mL，20μg/mL,30μg /mL,40μg /mL,50μg /mL,100μg /mL,150μg /mL，每9cm培养皿倒入10mLCM培养基（蔗糖10 g/L，酸水解酪蛋白6 g/L，酵母提取物6 g/L, 琼脂粉15 g/L），分别加入原始浓度为1g/20mL的潮霉素B 2μL,4μL,6μL,8μL,10μL,20μL,30μL,三次重复，接种菌丝块于皿中央，封口倒置于26℃培养箱。每天观察菌落长势，5天后测量菌落直径。结果发现，病菌在40μg/mL的潮霉素B平板上完全不能生长，低于这个浓度时也只有慢速稀薄生长。因此，用于椰子茎泻血病菌转化时所用到选择培养基中潮霉素B的浓度40-100μg/mL。

2 制备原生质体的菌源准备

从生长5天的菌落平板上，切一小菌块接种到CM培养基上，26℃培养24h，备用。

3 实验试剂

所选用的溶壁酶（Lysing Enzymes）和崩溃酶（Drislase），购自SIGMA公司。设三个酶组合，分别是单独使用溶壁酶、崩溃酶及同时使用溶壁酶和崩溃酶。设置浓度梯度为2.5 mg/mL，5.0mg/mL，7.5 mg/mL，10 mg/mL的酶液，其中两酶同加时等量配置。酶液用不同渗透剂配置，所选渗透压稳定剂有5种，分别1mol/L甘露醇（Manitol）, 1mol/L山梨醇（Sorbitol）, 0.7mol/L NaCl, 0.7mol/L KCL,0.7mol/L MgSO₄.7H₂O。

原生质体的制备过程

步骤一：研磨幼嫩病原菌丝接种到液体酵母淀粉培养基（酵母粉2 g/L，可溶性淀粉10 g/L，蔗糖3g/L）震荡培养，转速120rpm,26℃培养36h。用灭菌的微细绒布(Microcloth)过滤菌丝，然后用无菌水冲洗菌丝，再用1mol/L的甘露醇充分洗涤，用灭菌滤纸吸干水分。

步骤二：用已灭菌的50mL三角瓶盛装已过滤除菌的的7.5mg/mL崩溃酶液(以1mol/L的Manitol配制)10mL，取1.0g步骤一中洗涤并吸干的菌丝，用枪头轻轻吸打吹散均匀，将该三角瓶放入31℃恒温培养箱震荡培养1小时 ，转速90rpm。结束后，用三层灭菌Microcloth过滤菌液于50mL尖底离心管中，转速4000rpm,4℃，离心10min，弃上清，用20mLSTC（1.2M山梨醇,50mM Tris-Cl,pH8.0,50mM CaCL₂）轻轻吸打混匀，仍于上述转速，温度，时间进行二次离心，弃上清，以3mLSTC溶解即可得到3.05×10⁹个/mL的原生质体，再加入10%的DMSO,分装，150μL /管，置于-80℃冰箱长期保存。

步骤三：

取2μg 绿色荧光蛋白pCT74-sGFP质粒，转入150μL原生质离心管中,轻轻弹匀，静止30min,加1200μL PTC（40%聚乙二醇3350，1.2M山梨醇,50mM Tris-Cl,pH8.0,50mM CaCL₂）混匀，静止20min,转入50mL离心管中，加入6mL TB3溶液于26℃，90rpm,复苏12h。然后将复苏液倒入100mL 50℃左右含有160μL潮霉素B（1g/20mL）的TB3固体培养基中混匀，倒入直径15cm的培养皿中，冷凝，封口。26℃倒置3-4天，待转化子长出连续转接3代到含有160μL潮霉素B（1g/20mL）的PDA上筛选性状稳定的转化子，再连续培养4代在无潮霉素B的PDA培养基上以确保其遗传稳定性，即获得了具有绿色荧光蛋白标记的椰子茎泻血病菌菌株，菌丝及孢子都具会发出绿色荧光如图3所示。

为了进一步验证，椰子茎泻血病菌株里确实已经插入了GFP基因，根据TOX-A-GFP序列设计特异引物，对具有荧光的8个转化子提取DNA，进行PCR扩增，以质粒pCT74-sGFP PCR为阳性对照，以未转入GFP的菌株DNA为阴性对照，得到与阳性对照大小一致的条带即表明确已转入了GFP基因，如图2所示。

以下仅对实施过程中的相异处进行说明，重复部分不再赘述。

实施例二

本实施与实施例一相比的相异之处在于：在步骤一中用灭菌的0.7mol/LMgSO4.7H2O溶液充分洗涤菌丝；步骤二中震荡培养时间为1小时 30min，以MgSO₄.7H₂O为稳渗剂，以溶壁酶（Lysing Enzymes）和崩溃酶(Drislase)为裂解酶时，各酶量均为7.5mg/mL时，二次离心获得的原生质体的浓度是1.81×10⁹个/mL。

实施例三

本实施例与实施例一的不同点是：在步骤一分别以1mol/L山梨醇（Sorbitol）, 0.7mol/L NaCl充分洗涤菌丝；步骤二中震荡培养的时间是4h,以NaCL为稳渗剂，以10mg/mL的溶壁酶（Lysing Enzymes）和崩溃酶(Drislase)为裂解酶时，二次离心可获得原生质体的浓度是6.15×10⁸个/mL；若步骤二中以山梨醇（Sorbitol）为渗透剂，以溶壁酶10mg/mL（Lysing Enzymes）为裂解酶时，二次离心可获得1.73×10⁹个/mL的原生质体。综上所述，本发明确定了形成原生质体的合适条件，且稳渗剂和酶可以选择。综合时效和节约的原则，选择以1mol/L的甘露醇为稳渗剂，以7.5mg/mL的崩溃酶为裂解酶最好。表现为原生质体的得率最高，且用时最短。而在原生质体再生率方面，上述三个实施案例差异不大。此发明为椰子茎泻血病菌原生质体转化、致病性缺陷突变体的筛选等提供了可靠的来源，为菌种改良、有用基因克隆或基因的功能研究提供了重要途径，且显著地缩短了研究时间，提高了转化效率。