犬冠状病毒RT—PCR检测方法的建立和初步应用

摘要

根据Ｗｅｓｅｌｉｎｇ发表的犬冠状病毒（ＣＣＶ）Ｋ３７８株纤突蛋白（Ｓ）基因序列，设计合成了４条寡聚核苷酸引物Ｐ１（１８ｂｐ，１５２０～１５３７ｂｐ）、Ｐ２（１９ｂｐ，２０７２～２０９０ｂｐ）和Ｐ３（２０ｂｐ，２６２１～２６４０ｂｐ）、Ｐ４（２０ｂｐ，２９４４～２９６３ｂｐ）。以此为引物，以从美国引进的ＣＣＶＮＬ－１８参考株反转录产物为模板，在国内首先建立了ＣＣＶＲＴ－ＰＣＲ方法，并初步应用于国内ＣＣＶ分离株的鉴定。结果表明，以Ｐ１、Ｐ２和Ｐ３、Ｐ４为引物，只能从ＣＣＶＮＬ－１８株反转录产物中扩增出大小分别为５７１ｂｐ和３４３ｂｐ核苷酸片段，与理论设计值大小一致，而正常ＣＲＦＫ细胞和狂犬病等５种对照病毒扩增结果为阴性。ＲＴ－ＰＣＲ可检出１μＬ做１０５和１０３倍稀释的ＣＣＶＮＬ－１８株反转录产物，说明其具有很高的敏感性。初步应用试验结果，可从２株国内分离的ＣＣＶ反转录产物中扩增出５７１ｂｐ和３４３ｂｐ核苷酸片段。通过本研究不仅建立了敏感、特异的ＣＣＶＲＴ－ＰＣＲ检测方法，也为其Ｓ基因的克隆和序列测定奠定了基础。