蜜蜂残翅病毒两步法荧光定量PCR检测方法的建立

摘要

为了建立一种灵敏度更高的蜜蜂残翅病毒两步法荧光定量PCR检测方法,根据残翅病毒保守基因片段设计引物,采取反转录过程与荧光定量PCR过程分步进行的方式,建立基于SYBR染料法检测残翅病毒的两步法实时荧光定量PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、稳定性和可行性进行验证。结果显示,建立的两步法荧光定量PCR检测方法采用的引物特异性良好,在6.58×10^(1)~6.58×10^(8)拷贝/μL质粒标准品间具有良好线性关系,R^(2)为0.9997,扩增效率为100.8%。该方法的灵敏度为6.58拷贝/μL,与蜜蜂黑蜂王台病毒和以色列急性麻痹病毒不发生交叉反应,组内变异系数为0.20%~0.66%,组间变异系数为0.08%~0.98%,对蜜蜂样品残翅病毒的阳性检出率明显高于普通PCR,具有良好的特异性、重复性和实用性。综上,成功建立了一种灵敏度高、适用性好的残翅病毒两步法实时荧光定量PCR检测方法,为我国蜜蜂残翅病的流行病学调查、疫情监测和预警机制的构建提供新的技术支持。