基于CRISPR-Cas9的拟南芥基因编辑后代鉴定技术的优化

摘要

利用CRISPR-Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated nuclease 9)系统对植物进行定点编辑的技术已经日渐成熟,但对于被编辑植株后代的鉴定依旧费时费力,以拟南芥SDP1(Sugar-dependent 1)基因为编辑对象,优化编辑植株后代的鉴定方法.对SDP1基因序列进行分析表明,SDP1基因外显子上含有PAM(Protospacer adjacent motif)序列,且其上游合适的酶切位点有4个,选择第二外显子上含有最常见的SacⅠ酶切位点的20 bp序列作为基因敲除的靶位点,构建了CRISPR-SDP1-Cas9载体,实现对SDP1基因的定点编辑.对经过潮霉素筛选的T1株系DNA进行酶切鉴定和测序峰图分析,选出SacⅠ酶切为3条带的杂合编辑植株,随机挑选的71株T1植株中有24株发生了杂合编辑,编辑效率为16.9％.在48株T2转基因植株中有5株发生了纯合编辑,经测序编辑位点均为SacⅠ酶切位点上碱基插入.综上,选用待编辑基因上PAM序列附近合适的酶切位点作为编辑靶点,通过酶切和测序峰图分析来鉴定后代植株,相比于传统方法对后代植株提取DNA、PCR扩增靶位点、连接T载体后进行多次测序,此方法方便、快捷且经济实用,为CRISPR-Cas9基因编辑后代鉴定提供了简单、快捷的方法.