应用CRISPr-Cas9技术对大麦棱型皮裸基因进行基因编辑的初步研究

摘要

大麦是世界上第四大谷类作物，可作为饲料、食品生产或啤酒酿造的原料，是典型的“三元作物”。控制大麦棱型的六棱基因vrs1，为位于2H染色体长臂上的隐性基因，是独立遗传的，它的等位基因Vrs1能够抑制侧小穗的发育，从而导致二棱的形成。很多研究表明，大麦棱型性状和大麦的产量有着密切联系。单隐性基因nud位于大麦7H染色体长臂上，控制裸颖果的性状，像棱型基因一样，Nud基因对大麦的品质性状也有着显著的影响。为了获得高产量和高品质的大麦品种或种质，本研究使用农杆菌介导法，利用CRISPR-Cas9技术对棱型Vrs1基因和皮裸基因Nud进行基因组的定点编辑，以期获得二棱性状向六棱性状转变以及皮颖果性状向裸颖果性状转变的大麦基因编辑植株。文中分别选取了华大麦5号，华大麦6号和浙农大3号的幼胚愈伤组织转化以棱型基因Vrs1为靶基因的载体，华大麦4号和华大麦7号的幼胚愈伤组织转化以皮裸基因Nud为靶基因的载体，同时对华大麦5号和华大麦6号的成熟胚愈伤组织进行了棱型基因Vrs1为靶基因的转化，最终以潮霉素为筛选标记基因，成功获得了部分不同大麦品种的转基因阳性植株，同时对幼胚愈伤分化率与培养时间的关系进行分析，主要结果如下:
　　(1)在农杆菌介导棱型基因Vrs1对大麦幼胚愈伤组织的转化试验中，共得到14株抗性植株，其中华大麦5号未得到再生植株。经PCR检测，共有潮霉素基因阳性植株有4株，分别为浙农大3号和华大麦6号各2株。
　　(2)在农杆菌介导棱型基因Vrs1对大麦成熟胚愈伤组织的转化试验中，使用的大麦品种为华大麦5号和华大麦6号，最终没有得到抗性苗。
　　(3)在农杆菌介导皮裸基因Nud对大麦幼胚愈伤组织的转化试验中，华大麦7号得到5株抗性苗，而华大麦4号未得到抗性苗。经PCR检测得到1株潮霉素基因阳性植株。
　　(4)幼胚愈伤组织侵染后在分化培养基上分化时，华大麦6号和浙农大3号在培养时间8周时愈伤组织分化率最高，而华大麦7号在培养12周时分化率最高。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 文献综述

1．1 大麦遗传转化的研究

1．1．1 直接转化法

1．1．2 间接转化法

1．1．3 转基因技术在大麦遗传转化中的应用

1．2 大麦愈伤组织分化能力的研究

1．2．1 基因型对愈伤分化的影响

1．2．2 激素对愈伤组织分化的影响

1．2．3 外植体材料对愈伤组织分化的影响

1．3 Vrs1基因研究进展

1．3．1 大麦棱型与农艺性状的关系

1．3．2 大麦棱型与抗逆性的关系

1．4 Nud基因研究进展

1．5 CRISPR-Cas系统

1．5．1 CRISPR-Cas系统结构

1．5．2 CRISPR-Cas9原理

1．5．3 CRISPR-Cas9应用

1．6 研究目的与意义

2 试验材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 供试材料

2．1．2 转化载体

2．2 试验方法

2．2．1 大麦基因组DNA的提取

2．2．2 PCR扩增

2．2．3 目的片段的回收

2．2．4 目的片段与载体的连接反应

2．2．5 大肠杆菌感受态细胞的制备

2．2．6 质粒提取

2．2．7 质粒向大肠杆菌的转化

2．3 农杆菌介导法对大麦愈伤组织的转化

2．3．1 培养基

2．3．2 转化过程

2．4 转基因植株的检测

2．4．1 植物DNA粗提取(CTAB法)

2．4．2 电泳缓冲液

2．4．3 PCR检测

3 数据统计与结果分析

3．1 Vrs1基因和Nud基因序列获取及载体构建

3．2 农杆菌介导棱型基因Vrs1的转化

3．2．1 农杆菌介导棱型基因Vrs1对大麦幼胚愈伤组织的转化

3．2．2 农杆菌介导棱型基因Vrs1对大麦成熟胚愈伤组织的转化

3．2．3 农杆菌介导皮裸基因Nud对大麦幼胚愈伤组织的转化

3．2．4 幼胚愈伤组织培养分化率与培养时间的关系

3．3 菌液PCR检测结果

3．4 目的基因PCR检测结果

3．5 总结

4 讨论

4．1 转化效率

4．2 幼胚愈伤与成熟胚愈伤的比较

4．3 幼胚愈伤分化率与培养时间的关系

参考文献

附录

致谢