禽流感(H9N2亚型)酶标抗体的制备及双抗夹心Dot-ELISA检测方法的建立

摘要

采用AIV灭活油乳苗(H9N2)对AIV非免疫鸡进行接种并获取高免血清,取高免血清采用饱和硫酸铵沉淀法,经过Sephadex G25层析柱提纯后可获得纯度很好的IgG.将IgG应用过碘酸钠法标记辣根过氧化酶(HRP),制备禽流感酶标抗体(IgG-HRP),利用所提取的AI-IgG和所制备的禽流感酶标抗体按照双抗夹心Dot-ELISA试验操作步骤,采用方阵法分别摸索包被抗原及酶标抗体的最佳浓度,以及各步反应时间等最佳反应条件,以建立一种优化的AIV双抗夹心Dot-ELISA检测法.结果表明,所制备的AI高免血清HI效价为10log2;AI酶标抗体克分子比值为2.45;优化的Dot-ELISA各条件为:包被AI-IgG最佳稀释倍数为1:50;最佳封闭剂为1%牛血清白蛋白;AI酶标抗体最佳稀释倍数为1:100;待检抗原与2种抗体的感作时间均为0.5h(37℃).优化后的检测方法可在2.5h内诊断结果,制备好的包被膜在4℃下保存2个月不影响其效果.而且敏感性提高了3倍,与新城疫病毒液、传染性支气管炎及减蛋综合症病毒液无交叉反应.