水稻基因组文库的构建及YR-DNA的筛选

摘要

为了克隆决定染色体形成的特异DNA片段YR-DNA．以λExCell为载体，克隆经限制性内切酶EcoRI消化后的水稻基因组DNA，λ噬菌体体外包装构建了滴度为1．2×10^6 pfu／ml，重组效率达86％的小型水稻基因组文库．随机选取了50个重组克隆。质粒释放后进行酶切鉴定，插入序列的大小为0．5～7kb，平均为3kb．以水稻基因组DNA为探针对基因组DNA文库进行筛选．从10000个重组子中选出200个杂交信号较强的阳性克隆，质粒释放后点渍杂交进行第2轮筛选．从中选取40个杂交信号较强的重组子．再次进行斑点杂交，选取10个杂交信号最强的重组子．酶切并回收基因组插入片段，标记特异的重组片段，与不同酶切后的水稻基因组DNA进行Southern杂交，其中有两个探针杂交后基因组酶切带上杂交信号呈弥散状，表明重组片段为散在重复序列．