桔梗皂苷D治疗肥胖的潜在作用机制研究

摘要

目的 利用网络药理学与分子对接的方法探讨桔梗皂苷D(PD)治疗肥胖的潜在作用靶点及相关通路,并通过体外实验进行初步验证。方法 通过Gene Card、OMIM和TTD数据库检索肥胖相关靶点,使用CTD、HREB、SEA以及Swisse Target prediction等平台,并结合查阅相关文献获取PD的靶点,利用VENNY作图获取药物与疾病基因交集靶点并获得关键基因;利用STRING、R软件进行蛋白相互作用(PPI)与GO、KEGG通路富集分析,通过微生信平台将结果可视化,并构建药物-靶点-通路网络图;最后采用分子对接技术,将PD分别与AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)、固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)及脂肪酸合成酶(FAS)进行分子对接;以小鼠3T3-L1前脂肪细胞作为研究对象,取对数生长期的3T3-L1前脂肪细胞,分别给予5、10、20、40、60、80μmol/L PD处理24、48及72 h;采用细胞增殖实验(CCK-8)法测定细胞存活率,流式细胞仪检测PD对3T3-L1前脂肪细胞凋亡的影响,采用油红O染色检测PD在3T3-L1前脂肪细胞中脂滴的积累情况,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)实验检测不同浓度PD对固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)、脂肪酸合成酶(FAS)的m RNA及蛋白表达的影响。结果 获得PD与肥胖交集靶点131个,网络拓扑分析筛选出关键靶点10个;PPI结果显示,PD对应的关键靶点基因为蛋白激酶B-α(AKT1)、肿瘤蛋白p53(TP53)、信号传导与转录激活因子3(STAT3)、白介素6(IL6)、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子受体(EGFR)等;GO富集分析显示,PD与类固醇结合、细胞氧化应激、线粒体生成等相关;KEGG通路分析结果表明,其可调控154条信号通路,包括AMPK信号通路、脂肪细胞因子通路、胰岛素信号通路等;在分子对接中,PD与关键靶点AMPK、SREBP-1c、FAS的对接效果良好,结合能为-10.2~-8.8 kcal/mol;CCK-8结果显示,PD浓度<20μmol/L为安全浓度范围,且不造成细胞凋亡;油红O染色结果显示,PD可抑制细胞分化,并具有浓度依赖效应;PD能够显著抑制SREBP-1c、FAS的表达。结论 PD可以通过调控多靶点、多通路对肥胖产生影响,其抑制3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的作用机制可能与下调SREBP-1c、FAS蛋白表达有关。