抑制性消减杂交构建凋亡肝癌细胞差异表达cDNA文库

摘要

目的应用抑制性消减杂交技术构建肝癌细胞凋亡消减杂交cDNA文库,以期克隆肝癌细胞凋亡相关基因。方法用三氧化二砷诱导人肝癌HCC-9204细胞凋亡,提取poly A' RNA,反转录合成 cDNA,消化成短片段后分成两组,分别与两种不同的接头连接,再与普通肝癌细胞的cDNA进行两次杂交及两次抑制性PCR扩增,将PCR产物与PT-Adv线性载体连接,转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆进行酶切鉴定,反向Northern blot分析差异基因的可靠性。结果成功地构建了具有高消减效率的人肝癌凋亡细胞cDNA文库,随机挑取200个克隆制备质粒并酶切分析,其中83.5％的克隆均具有100bp-600bp左右的插入片段,随机选取30个插入片段,分别以未凋亡和凋亡的肝癌细胞cDNA为探针,进行Reverser Northern Blot,其中21个被证明为差异表达的细胞凋亡相关基因cDNA片段。结论应用抑制性消减杂交技术成功构建了人肝癌凋亡细胞cDNA消减文库,为大批量筛选、克隆肝癌细胞凋亡相关的未知新基因奠定了基础,有助于了解细胞凋亡的分子机制。