低表达Cbfa1基因的人牙周膜细胞模型的建立及鉴定

摘要

目的:构建针对核心结合因子a1(Cbfa1)的mU6小干扰RNA载体,并将其转染到人牙周膜细胞hPDLCs,观察其干扰效果,以期建立稳定的低表达Cbfa1基因的hPDLCs模型.方法:设计针对Cbfa1基因编码区的寡核苷酸链,体外退火后克隆入经双酶切线性化的小干扰载体mU6中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定.以脂质体法将mU6空载体和重组质粒分别导人hPDLCs细胞系.用含G418的培养液筛选,挑取阳性克隆后用RT-PCR技术检测各hPDLCs克隆内Cbfa1 mRNA水平的表达情况.结果:经酶切鉴定及DNA测序,重组质粒Cbfa1-siRNA中插入的目的基因片段与预计片段完全一致.G418筛选转染细胞4wk后获得稳定转染mU6空载体的细胞克隆株hPDLCs-mU6和稳定转染重组质粒的细胞克隆株hPDLCs-siRNA.经RT-PCR鉴定,Cbfa1在hPDLCs-siRNA细胞中的表达比对照细胞明显降低.结论:成功构建了针对Cbfa1的小干扰RNA载体,成功建立了稳定的低表达Cbfa1的hPDLCs模型,为进一步研究Cbfa1的功能奠定了实验基础.