斜带石斑鱼( Epinephelus coioides )病毒性神经坏死病毒的纯化分析及检测方法建立

摘要

根据GenBank中已有的鱼类病毒性神经坏死病毒(NNV)RNA2基因序列,设计引物,从福建厦门具有典型NNV发病症状的斜带石斑鱼中克隆了RNA2基因的全长序列,并将序列提交到GenBank获得登录号为MF510920,命名为XMNNV。系统进化树分析结果表明XMNNV与RGNNV聚类在一起,与SJNNV、BFNNV和TPNNV等其他鱼类神经坏死病毒亲缘关系较远,说明本研究分离得到的XMNNV属于RGNNV基因型。通过超速离心方法对病毒进行提纯,得到了纯化的NNV病毒。电镜观察结果表明,病毒粒子直径20~25nm,结构为正二十面体,与已经报道的NNV结构一致。通过对XMNNV与其它RGNNVRNA2基因进行序列比对,在保守区设计引物,运用RT-PCR方法建立了RGNNV的PCR检测方法,该方法灵敏度高达67copies/μL。纯化的病毒对E11(条纹月鳢细胞系)和大黄鱼肌肉细胞进行感染,结果表明该病毒可以感染这两种鱼类细胞。E11细胞被感染病毒后,细胞出现空泡化,并最终导致细胞分解死亡;大黄鱼肌肉细胞感染后,细胞变圆,慢慢从培养皿壁脱落,最终解体死亡。另外,对感染后细胞进行PCR检测,结果显示为阳性,进一步确定了分离的NNV具有感染这两种细胞的能力。本研究通过电镜观察和PCR检测两种方法确定了患病石斑鱼携带NNV,通过对两种鱼类细胞的感染实验,确定了该病毒具有一定的感染能力。综上,本研究为石斑鱼NNV疾病的诊断提供了有效的方法,对石斑鱼NNV疾病的预防具有一定的指导意义。