肝纤维化小鼠模型中弹性蛋白及其调控因子在肝纤维化形成和逆转中的分子机制

摘要

目的 明确弹性蛋白在四氯化碳(CCl4)小鼠肝纤维化模型中的表达特点,初步探索弹性蛋白沉积的相关分子机制.方法 建立CCl4诱导的小鼠肝纤维化形成模型,通过Western Blot、可溶性蛋白及维多利亚蓝染色检测纤维化早期(CCl4注射4周)和进展期(CCl4注射8周)弹性蛋白的变化,同时以橄榄油做为健康对照组;其次,建立纤维化自发逆转模型,通过LC-MS/MS检测不同逆转时间(逆转0周、逆转4周、逆转8周、逆转12周)血清蛋白组学的变化,寻找潜在的与弹性蛋白沉积相关分子,并通过qPCR进行验证.计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用Tukey检验.结果 弹性蛋白的相对表达量在早期纤维化组和进展期纤维化组分别为0.82±0.05、1.59±0.58,与健康对照组(1.00±0.11)相比,进展期纤维化组显著上升(P0.05),而进展期组显著升高[(352.0±57.0)μg/10 mg,P<0.05].肝组织弹性蛋白染色发现,与健康对照组(1.03±0.14)相比,弹性蛋白阳性面积早期纤维化组(2.08±0.16)和进展期纤维化组(4.39±0.51)均显著增加(P值均<0.05).进一步检测了弹性蛋白酶12的基因表达,与健康对照组(1.30±0.10)相比,弹性蛋白酶12的基因水平随纤维化进展表达显著升高(早期纤维化:15.50±2.90;进展期纤维化:22.70±4.10,P值均<0.05).利用LC-MS/MS分离并鉴定逆转过程中与肝纤维化进展和逆转相关的蛋白45种,其中与弹性蛋白沉积相关的蛋白包括赖氨酸氧化酶-1(LOXL-1)和Fibulin-1(FBLN-1).通过qPCR对LOXL-1和FBLN-1基因验证证实,LOXL-1和FBLN-1的基因水平在CCl4注射8周(逆转0周)达到高峰,且随着逆转时间的延长表达逐渐下降.结论 弹性蛋白沉积是进展期小鼠肝纤维化模型的重要特征之一,LOXL-1和FBLN-1介导的弹性蛋白沉积有可能成为肝纤维化特别是肝硬化和终末期肝病的治疗靶点.