凋亡相关蛋白BCL-B在肝纤维化逆转中对肝星状细胞凋亡的调节及机制研究

摘要

肝纤维化(hepatic fibrosis)是各种病因引起的慢性肝病反复损伤导致的以细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积为特征的病理生理过程，严重者会转化为肝硬化或肝癌，预后不良，死亡率高。
　　静态的HSCs富含维生素A，肝脏受到外来刺激时，细胞内维生素A脂滴消失，HSCs转化为活化状态，增殖、迁移能力增强，产生大量细胞外基质，该过程是肝纤维化发生的“中心环节”。
　　有研究表明，去除致病因素后肝纤维化能够发生逆转。肝纤维化逆转的关键是减少胶原分泌，增加其降解。有研究证实活化的HSCs是胶原纤维的主要来源，两项啮齿类动物研究表明，大约50％活化的肝星状细胞在纤维化逆转过程中发生凋亡，而其余的则恢复到静止表型。因此，以活化的HSCs作为靶点进行干预，诱导其凋亡、抑制其增殖及胶原分泌，可逆转肝纤维化。目前，对于治疗肝纤维化尚缺乏有效方法。因此，研究活化的HSC的凋亡机制，对于逆转肝纤维化具有重要意义。
　　细胞凋亡分为内源性凋亡和外源性凋亡，内源性凋亡又称为线粒体途径凋亡，其核心事件是线粒体外膜通透性增加（mitochondrial outer membrane permeabilization,MOMP）。MOMP主要是由活化的BH3-only蛋白诱发，该类蛋白可诱导Bcl-2（Bcell lymphoma-2）家族两个促凋亡分子BAX（Bcl-2-associated X protein）和/或BAK（Bcl-2 antagonist or killer）在线粒体外膜形成寡聚体，进而形成超分子通道介导线粒体膜间隙的蛋白释放，如细胞色素c（cytochrome c,cytc），进而触发内源性细胞凋亡。因此，线粒体稳态在细胞凋亡中起重要作用。
　　肝脏是一个高能耗器官，线粒体在能量生成过程中会产生大量的超氧阴离子，这些活性氧成分会损伤线粒体内蛋白、脂类及核酸，而功能蛋白的损伤会增加活性氧的产生、加剧线粒体损伤。当蛋白及DNA损伤累积到一定程度，超过其自身修复能力时，细胞会通过自噬方式对损伤线粒体进行选择性地清除，被称为线粒体自噬（mitophagy）。目前的观点认为，线粒体自噬性清除与细胞凋亡同时存在，但是目前并无文献明确地证明线粒体清除与凋亡的相互关系。HSC中的线粒体清除及其与肝纤维化的关系尚无报道。
　　目前认为Bcl-2家族蛋白同时参与了线粒体自噬性清除及细胞凋亡过程，该家族包括6个抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-B、Bcl-w、Bcl-xL、Bfl-1和Mcl-1）、许多促凋亡的BH3-only蛋白及其辅因子Bax和 Bak。Bcl-2家族蛋白定位于线粒体外膜，通过控制BAX/BAK寡聚体通道的聚合形成，从而调节线粒体外膜的通透性，启动内源性细胞凋亡。该家族蛋白还可通过结合于自噬调节因子beclin-1阻断自噬小体的形成，Bcl-2/Beclin1相互作用是细胞自噬的关键调节点。Bcl-B（又称为BCL2L10）是最晚发现且研究最少的一个Bcl-2家族抗凋亡蛋白，具有其典型结构特征。Bcl-B在人体组织中广泛表达，而在HEK293T细胞中，可通过与Bax结合而抑制凋亡。目前Bcl-B在线粒体清除中的作用尚不清楚，并且Bcl-B在肝纤维化形成、逆转及HSC凋亡中的表达情况及其功能，未见报道。
　　本课题旨在观察 HSC凋亡及肝纤维化逆转过程中凋亡相关蛋白Bcl-B表达及线粒体含量的变化情况，阐明Bcl-B对HSC凋亡的调控作用及其可能的分子机制。
　　本学位论文由以下三部分组成：
　　第一部分：肝纤维化逆转小鼠模型中原代 HSC线粒体含量减少及BCL-B表达下调
　　目的：
　　建立纤维化逆转小鼠模型，观察在纤维化逆转过程中原代HSC的BCL-B表达及线粒体含量变化。
　　方法：
　　应用四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)腹腔注射法诱导小鼠肝纤维化，停药后自发逆转，建立肝纤维化逆转模型。肝组织石蜡切片经HE与Masson染色检测肝脏病理变化。赖氏法检测血清ALT、AST的含量。免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)和Western blot检测collagen I和α-SMA的表达。采用原位灌流、梯度密度离心技术分离小鼠原代HSCs，经光镜及荧光显微镜鉴定。Western blot检测线粒体蛋白TOM20的变化，PicoGreen检测细胞中线粒体DNA总量，评价线粒体清除情况。TUNEL和流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测细胞凋亡。Western blot检测BCL-B表达情况。
　　结果：
　　1.成功复制肝纤维化逆转小鼠模型
　　采用CCl4腹腔注射法诱导可逆性的肝纤维化，停止注射后，肝纤维化自发逆转，以此模拟肝纤维化逆转。实验分为5组：对照组（oil）、纤维化组（6w）、恢复1周组（R1w）、恢复2周组（R2w）、恢复4周组（R4w）。Oil组小鼠肝脏质地柔软，表面光滑，色泽鲜艳。CCl4给药6w组小鼠肝脏体积稍缩小，质硬，黄褐色，表面细颗粒样，随停药时间延长肝脏表面逐渐恢复光滑柔软。H&E及Masson染色结果显示，oil组小鼠肝板排列整齐，肝小叶结构完整，胶原纤维极少或缺如。6w组小鼠肝脏有出血、坏死，肝细胞空泡、脂肪变性，大量炎细胞浸润，肝板正常排列消失，小叶结构紊乱，胶原纤维组织明显增生沉积。随着停药时间延长，R1w、R2w、R4w组小鼠肝脏坏死逐渐得到改善，肝板排列逐渐恢复，肝细胞脂肪变性减少，胶原纤维组织减少。免疫组织化学结果表明，α-SMA和collagen I在6w组肝组织中阳性细胞数增多、染色加深，明显高于oil组，R1w组的表达较6w组无明显变化，随停药时间延长，R4w组的表达明显减少。Western blot结果显示，与oil组相比，6w组两种蛋白表达升高，随停药时间延长，两种蛋白的表达逐渐降低，在R4w组表达最低。CCl4腹腔注射6w时ALT、AST水平较oil组明显升高，停药后转氨酶水平逐渐下降。以上结果表明肝纤维化逆转模型复制成功。
　　2.成功提取小鼠原代HSCs
　　应用链酶及Ⅳ型胶原酶原位灌注后，进行梯度密度离心，分离小鼠原代HSCs。在波长328 nm的倒置荧光显微镜下观察，细胞可自发蓝绿色荧光。显微镜下，刚分离的HSCs未活化，呈圆形或椭圆形，体积较大，折光性强。经光镜及荧光显微镜鉴定，所提细胞纯度约为80％，得率约为1×105~1.5×105/小鼠。接种于塑料培养瓶24 h后，细胞全部贴壁，本研究取培养3天的原代HSC用于实验，此时细胞仍为静止状态，未被活化；较接近于在体状态。
　　3.肝纤维化逆转中原代HSCs凋亡增加
　　TUNEL染色结果显示，oil对照组中HSCs的凋亡较明显，6w组中HSCs凋亡明显减低，只有极少部分处于凋亡状态。肝纤维化逆转阶段，HSCs的凋亡均明显增多，但与停药时间无明显相关性。应用Annexin-V/PI双重染色，流式细胞术检测细胞凋亡，结果显示，与oil组相比，6w组HSCs凋亡显著减少，在停药后细胞凋亡增加，于停药2周时细胞凋亡最为明显，以早期凋亡为主，而在停药4周时表现为晚期凋亡为主，细胞总凋亡率与停药时间无明显相关性。表明在肝纤维化逆转中，HSCs凋亡增加。
　　4肝纤维化逆转中HSCs线粒体含量减少，BCL-B表达下调
　　从原代HSCs中提取蛋白，应用western blot方法检测线粒体膜蛋白TOM20的表达变化。结果显示，在6w肝纤维化组中，TOM20较oil对照组明显升高。随停药时间延长，TOM20的表达逐渐降低，在R4w表达最低，但仍高于oil组水平。表明在肝纤维化时，HSCs线粒体含量丰富；而在纤维化逆转过程中，HSCs线粒体清除增强，细胞内线粒体含量逐步减少。PicoGreen荧光染色观察原代HSCs中线粒体DNA（mtDNA）含量。结果显示，在6w组的HSCs中，胞浆中荧光亮度较oil组明显增强，且聚集形成团块状，面积较大，表明线粒体增多、融合。而在停药后的R1w组的细胞中，荧光强度明显减弱，且荧光团块明显减小。R2w组较 R1w组无明显变化，R4w组中荧光强度虽较前无明显变化，但荧光团块消失，胞浆中荧光较均匀一致。表明在纤维化形成时， HSCs中线粒体数量增加且融合聚集；在肝纤维化逆转过程中，线粒体逐渐分散在胞浆中，且数量减少。
　　Western blot结果显示，oil组中BCL-B表达较低，6w组中的表达明显升高，随停药时间延长、肝纤维化逆转，该蛋白的表达逐渐下降，在R4w组中表达接近oil组。表明BCL-B表达与原代HSCs的凋亡存在相关性。
　　结论：
　　肝纤维化逆转过程中HSCs的凋亡及线粒体清除增加，BCL-B表达下调。
　　第二部分：BCL-B对肝星状细胞凋亡及线粒体清除的影响
　　目的：
　　诱导HSC细胞株LX2凋亡，验证肝纤维化逆转小鼠模型中原代HSCs的结果。抑制线粒体清除，明确线粒体清除对HSCs凋亡的影响。在LX2中敲低及过表达BCL-B，观察其对LX2凋亡及线粒体清除的影响。
　　方法：
　　应用凋亡诱导剂GTX建立LX2凋亡模型，应用抑制剂CsA干预细胞抑制线粒体清除，设计并合成可敲低BCL-B表达的siRNA及过表达BCL-B的腺病毒，在LX2中敲低及过表达BCL-B。用western blot检测BCL-B、线粒体蛋白、凋亡相关蛋白及HSC活化相关蛋白的表达；PicoGreen检测线粒体DNA含量；TUNEL检测细胞凋亡，反映细胞凋亡、线粒体清除及BCL-B表达水平。
　　结果：
　　1.在HSC细胞株中诱导凋亡，线粒体清除增强，BCL-B表达下调应用胶霉毒素（Gliotoxin，GTX）诱导HSC细胞株LX2凋亡，在
　　细胞水平模拟肝纤维化逆转。
　　①TUNEL染色检测HSCs凋亡率，结果显示，GTX组细胞凋亡率较对照组显著升高。Western blot结果显示，与对照组相比，GTX组活化的凋亡相关蛋白cleaved-caspase3和活化的内源性凋亡相关蛋白cleaved-caspase9显著升高。同时，GTX组的HSC活化相关蛋白collagen I和α-SMA的表达明显减少。表明GTX成功诱导了HSCs凋亡。
　　②并且GTX组的线粒体蛋白TOM20较对照组显著降低。PicoGreen荧光染色法检测mtDNA含量，对照组胞浆中绿色荧光强度较高、呈颗粒状，诱导凋亡后，荧光明显减弱且散在分布。说明在凋亡细胞中线粒体总量减少且分散，表明在凋亡的LX2中，线粒体清除明显增强。
　　③Western blot结果显示，GTX诱导LX2凋亡后，BCL-B的蛋白表达水平较对照组明显降低。
　　2.抑制线粒体清除可抑制HSCs凋亡，上调BCL-B表达
　　①Western blot结果显示，用线粒体自噬抑制剂环孢菌素A（CsA）处理细胞后，线粒体膜蛋白 TOM20表达升高。 PicoGreen染色结果显示，加入CsA后细胞中绿色点状荧光的数量增加，强度升高。表明CsA成功抑制了线粒体的清除。
　　②TUNEL染色检测细胞凋亡结果显示，CsA干预后，细胞凋亡率降低。Western blot结果显示，与对照组相比，CsA刺激后，活化的凋亡相关蛋白cleaved-caspase9及cleaved-caspase3降低。并且HSC活化指标Collagen I和α-SMA的表达显著升高。表明抑制线粒体清除后LX2凋亡减少。
　　③Western blot结果显示，CsA抑制线粒体清除后，BCL-B升高。
　　3.敲低BCL-B促进HSCs凋亡及线粒体清除
　　在LX2转染BCL-B特异性的siRNA（siBCL-B），并转染无关序列的siRNA（siCon）作为对照组，收集蛋白检测BCL-B表达。
　　①Western blot结果显示，siBCL-B组较siCon组BCL-B蛋白表达减少了79%，说明 BCL-B被成功敲低了。
　　②用TUNEL染色检测细胞凋亡，结果显示siBCL-B组的细胞凋亡率较siCon组明显升高。Western blot结果显示，敲低BCL-B后，与siCon组相比，cleaved-caspase9及cleaved-caspase3蛋白水平升高。同时，collagen和α-SMA表达明显下调。说明敲低BCL-B会导致LX2凋亡增加及分泌功能降低。
　　③Western blot检测线粒体蛋白TOM20结果显示，siBCL-B组中TOM20蛋白表达较siCon组显著降低。PicoGreen结果显示，siBCL-B组细胞中的荧光强度及面积均较siCon组降低，说明mtDNA减少。表明敲低BCL-B后，LX2中线粒体数量减少，线粒体清除增加。
　　4.过表达BCL-B可抑制LX2凋亡及线粒体清除
　　通过感染腺病毒载体在LX2中过表达BCL-B（adBCL-B），对照组感染空载体腺病毒（adCon）。感染效率可达90%以上。
　　①应用Western blot检测BCL-B蛋白表达，结果显示adBCL-B组较adCon组升高约4.7倍,说明BCL-B被成功过表达。
　　②TUNEL染色检测细胞凋亡，结果显示，与adCon组相比，adBCL-B组细胞凋亡率明显降低。Western blot结果显示，较adCon组，adBCL-B组cleaved-caspase9和cleaved-caspase3显著降低。同时，adBCL-B组的collagen I和α-SMA表达增加。说明过表达 BCL-B能抑制LX2凋亡，并促进其活化。
　　③对线粒体蛋白TOM20的表达进行检测，结果表明，与adCon组相比，adBCL-B组TOM20的表达升高。表明过表达BCL-B的细胞中线粒体含量增加，线粒体清除被抑制。
　　结论：
　　抑制线粒体清除导致细胞凋亡减少。BCL-B可抑制LX2凋亡及线粒体清除。
　　第三部分：BCL-B通过抑制细胞线粒体清除抑制HSC凋亡
　　目的：
　　明确BCL-B是否通过抑制线粒体清除调节细胞凋亡。探讨BCL-B抑制线粒体清除的分子机制。
　　方法：
　　在敲低BCL-B的LX2细胞中应用线粒体自噬抑制剂，通过Western Blot检测线粒体蛋白表达及PicoGreen检测mtDNA验证线粒体清除被抑制，应用Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达；TUNEL法检测细胞凋亡率。敲低或过表达BCL-B，检测细胞中p-Parkin的表达变化。应用免疫共沉淀和免疫荧光双染的方法检测 LX2细胞中BCL-B与p-Parkin是否存在相互结合。
　　结果：
　　1.抑制线粒体清除可抑制BCL-B敲低对LX2的作用
　　为明确BCL-B是否通过抑制线粒体清除来抑制细胞凋亡，在敲低BCL-B的细胞中阻断线粒体清除过程。
　　①检测线粒体蛋白表达情况，结果显示，siBCL-B+CsA组的线粒体膜蛋白TOM20表达量较siBCL-B组明显升高。PicoGreen检测mtDNA结果显示，CsA干预后较单纯siBCL-B转染组的荧光强度明显增强，荧光颗粒更聚集。说明CsA成功抑制了线粒体清除。
　　②TUNEL法检测细胞凋亡情况，结果显示，siBCL-B+CsA组较siBCL-B组细胞凋亡率明显降低。与siBCL-B组相比，siBCL-B+CsA组的cleased-caspase3和cleased-caspase9水平明显降低；而collagen I和α-SMA的蛋白表达量升高。表明抑制线粒体清除可抑制BCL-B敲低诱导的LX2凋亡。
　　2.BCL-B下调p-Parkin水平
　　Parkin的磷酸化活化是启动线粒体自噬的关键。Western blot结果显示，敲低BCL-B使p-Parkin的水平升高，而过表达BCL-B时，p-Parkin水平明显降低。表明BCL-B可抑制线粒体自噬关键蛋白Parkin的磷酸化活化。
　　3.BCL-B与p-Parkin存在相互作用
　　①免疫共沉淀结果显示，以兔抗p-Parkin（鼠抗BCL-B）对LX2总蛋白进行交互沉淀，并用兔抗IgG（鼠抗IgG）沉淀作为对照，在IgG沉淀组未检测到条带，在p-Parkin及BCL-B沉淀组分别检测到BCL-B和p-Parkin的条带，说明BCL-B和p-Parkin存在相互结合。
　　②用红色荧光标记BCL-B，用绿色荧光标记p-Parkin，用带蓝色荧光的DAPI标记细胞核，进行免疫细胞荧光染色。结果显示，在LX2中，绿色荧光标记的p-Parkin分布于细胞质，核周区域较为集中，红色荧光标记的BCL-B在胞浆中呈斑点状分布，两者荧光部分重叠（黄色区域），表明 BCL-B与p-Parkin存在部分共定位。
　　结论：
　　BCL-B可通过抑制线粒体清除抑制HSC凋亡。在HSC中，BCL-B和p-Parkin蛋白存在相互作用，BCL-B可能通过与p-Parkin结合，抑制其磷酸化活化，从而抑制线粒体自噬性清除。

目录

声明

英文缩写

引言

第一部分肝纤维化逆转小鼠模型中原代HSC线粒体含量减少及BCL-B表达下调

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分BCL-B对肝星状细胞凋亡及线粒体清除的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分BCL-B通过抑制细胞线粒体清除抑制HSC凋亡

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述:线粒体自噬及其在多种疾病中的作用

致谢

个人简历